イオンチャネル2次元密度と1分子活性：膜タンパク制御の新基軸展開に向けて
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21K19212
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
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| Keywords | チャネル / 脂質2重膜 / 離合集散 / 電気生理 / 蛍光 / 集散 |
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| Outline of Research at the Start |
脂質2重膜上における膜タンパク質2次元密度を自由自在に制御する実験手法を確立し、イオンチャネル1分子機能解析に応用することで、密度－活性関係の解明を目指す。ポイントは、①独自の脂質2重膜実験法でのリアルタイム膜面積操作によるタンパク質2次元密度制御、②高密度集団中にある1個の分子だけから活性の信号を取得する実験デザイン、である。これら2つを組み合わせ、“2次元分子密度軸に沿った活性制御”という、タンパク質制御概念の新基軸展開に挑戦する。本研究では、そのたたき台となる最も基礎的な実験データの取得を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜中での分子密度と1分子活性の関係を調べるために、2次元密度にのみ関与する不活性なKcsA変異体の作製を試みた。しかし、適切な変異導入部位を見つけることができなかった。そこで、研究を進めるために、巨視的活性の観点から検討を行った。具体的には、巨視的電流が測定できるほどのKcsAチャネル分子を脂質二重膜に組み込んだ。その後、膜面積を減少させながら巨視的電流を観測した。この操作は、脂質二重膜を接触面とする2つの油中水滴バブルを引き離すことで行った。この操作中、巨視的電流値は膜面積の減少に対して大きく変化しなかった。これは、膜面積の操作が既に膜に組み込まれたKcsAチャネル分子数を変えず、結果として膜内での分子密度を変えることができることを示している。
さらに、昨年度に引き続き、蛍光標識したKcsAチャネルを全反射蛍光顕微鏡ステージ上の水平な脂質二重膜に組み込み、全反射蛍光観察で見られる輝点の消光ステップ数を解析した。KcsAチャネルはホモ4量体で形成され、1つのチャネルには4分子の蛍光色素が結合する。輝点が1つのチャネル分子に由来するのか、それとも複数のチャネル分子が集合しているのかは、消光ステップ数から推定できる。KcsAチャネルは酸性pHで活性化し、また、陰イオン性リン脂質を含む膜では活性が増強する。活性と離合集散の関係を解明するために、電解質溶液のpH条件や脂質二重膜の脂質組成を変えて、輝点の消光ステップ数の解析を行った。
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Report
(3 results)
Research Products
(33 results)
