Identification of host factors that regulate Alu retrotransposition
Project/Area Number |
21K19219
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Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
三好 知一郎 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (60378841)
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Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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Keywords | Alu / レトロトランスポゾン / 転移 / LINE-1 / ゲノム / SINE |
Outline of Research at the Start |
本研究は、Aluとよばれるゲノム上を移動するレトロトランスポゾンの分子機構を明らかにすることを目指し、生化学と遺伝学を融合したアプローチによって、その宿主制御因子を同定しようという試みである。Aluは個体間のゲノムバリエーションを生み出す原動力となる一方で、破滅的な遺伝情報の破壊も引き起こし、場合によっては疾患原因となる遺伝子変異を伴う。この転移を繰り返すAluの分子機構は殆ど分かっておらず、その宿主制御因子を発見することは、我々のゲノムの成り立ちや、発生過程および環境変動によって変化するゲノムの性質を知る上で極めて重要である。
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Outline of Annual Research Achievements |
現在、Aluの転移をモニターするレポーターコンストラクトは、G418耐性遺伝子ただ1種類しか存在しない。このためコロニー形成能の低い細胞株や既に遺伝子改変によりG418耐性となっている細胞株についてはAluの転移を観察することができない。そこでAluの転移アッセイをより多くの細胞株に適用し、かつその制御因子を広範に探索するための遺伝学スクリーニングへと発展させるために、これを蛍光蛋白質によって可視化する手法の開発に取り組んだ。初年度は、転移を可視化するための候補コンストラクトを複数作成した。本年度は、これらを改変して多くの細胞株に用いることができる汎用ベクターと組み合わせることで実用化を目指した。そのためにL1のORF2pとAluの転移可視化コンストラクトを共発現するベクターを新たに作成し細胞に導入したところ、これまでに報告されているG418耐性遺伝子で得られたAluの転移頻度と、蛍光蛋白質で可視化した場合で、ほぼ同等の転移頻度が観察された。またこれはL1の逆転写酵素活性を失活させると蛍光蛋白質を発現する細胞がほとんど観察されなかったことから、Aluの転移を蛍光蛋白質で可視化し、定量化することが可能であることを示唆している。しかし、今後ゲノム解析をすすめ、本当にAluがゲノム内に挿入されたのかを確認する必要がある。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aluの転移を可視化する新たなレポーターコンストラクトを構築することにほぼ成功した。現在これらの蛍光蛋白質陽性細胞からゲノムDNAを取得しており、本当にAluがゲノム内に挿入されたのかを確認する必要があるが、Alu転移解析の基盤技術が整いつつあるといってよい。蛍光タンパク質を利用して、Aluの転移細胞をFACS解析によって定量化する手法を確立し、ソーティングする技術と組み合わせて、遺伝学的スクリーニングを実施を目指す。
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Strategy for Future Research Activity |
上記で記載したように、今後蛍光タンパク質を利用して、Aluの転移細胞をFACS解析によって定量化する手法を確立し、ソーティングする技術と組み合わせて、遺伝学的スクリーニングを実施を目指す。そのためにはCas9の恒常的な発現細胞株を樹立し、ノックアウト効率が高いクローンを選別する必要があるので、Aluの転移を許容する細胞株を主にこの作成に取り組んでおり、これまでに候補クローンを得つつある。またこれまでにL1 ORF2pはAlu転移に必要であるが、これと相互作用する因子を質量分析によって取得しその解析をすすめるも、対象因子が膨大であるため、これまでに得た生化学的解析結果を今後取得する遺伝学的スクリーニングで得られたAlu制御因子と比較することが重要だと考えられる
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Report
(2 results)
Research Products
(15 results)