| Project/Area Number |
21K19225
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
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| Keywords | 光照射分子不活性化技術 / 超解像イメージング / 蛍光タンパク質 / 指向性進化法 / 光スイッチング / 試験管内分子進化 / 蛍光顕微鏡 / 活性酸素種 / フォトクロミズム / ミトコンドリア |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、光の回折限界を超えた高い空間分解能を有する超解像光照射分子不活性化技術（SR-CALI）を開発することが目的である。特に、SR-CALIのための光スイッチング光増感性蛍光タンパク質の開発、SR-CALIのための超解像顕微鏡装置の開発、そしてSR-CALI技術のコンセプトの実証として細胞内小器官内のタンパク質機能解析へのSR-CALIの応用を行う。本研究により、従来実現していなかった、細胞内小器官やタンパク質複合体1個1個のスケールでのCALIを可能にする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、光の回折限界以下の細胞内微小領域やタンパク質などの生体分子複合体等の不活性化による細胞機能解析技術となる、超解像光照射分子不活性化法（SR-CALI）を開発することである。具体的な研究内容は、標的を不活化する活性酸素種を微小領域で発生させるためのタンパク質（SR-CALIタンパク質）の開発、SR-CALIのための超解像顕微鏡装置の開発、そして細胞内微小領域においてSR-CALIが起こることを確認してSR-CALIのコンセプトを実証することである。
本年度は、活性酸素種が発生可能な状態（CALI-ON）と発生しない状態（CALI-OFF）の二状態の光照射による制御可能なタンパク質（RS-CALIタンパク質）の開発を行った。このために、活性酸素種発生タンパク質（CALIタンパク質）と光スイッチング蛍光タンパク質を融合することで、フェルスター・エネルギー移動（FRET）を介して光スイッチング能が付与されたSR-CALIタンパク質（FRET型SR-CALIタンパク質）の作製を進めた。昨年度開発したFRETドナーとして動作する光スイッチング蛍光タンパク質とCALIタンパク質で構成される融合タンパク質をテンプレートとして用い、部位飽和変異導入法やランダム変異導入法で多数の変異体を作製しスクリーニングすることで、FRET効率の最適化を行った。このようにして作製した融合タンパク質は、キュベット中の分光測定により、ドナータンパク質側の光スイッチングに伴ってCALIタンパク質側の蛍光強度が変化したことより、光スイッチング能を確認した。ただし、この融合タンパク質は細胞内において光スイッチングのコントラストが十分でないことがわかったため、さらに改良を進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、活性酸素種を発生可能な状態（CALI-ON）と発生しない状態(CALI-OFF)の2状態を光照射によって制御（光スイッチング）可能なタンパク質（SR-CALIタンパク質）の開発を行った。これは、光スイッチング能を持たない活性酸素種発生タンパク質（CALIタンパク質）と光スイッチング蛍光タンパク質の融合タンパク質であり、光スイッチング蛍光タンパク質からのフェルスター・エネルギー移動（FRET）によってCALIタンパク質が励起され、活性酸素種を発生するもの（FRET型SR-CALIタンパク質）である。昨年度は、蛍光状態（ON）と暗状態（OFF）の2状態間を遷移する新規光スイッチング蛍光タンパク質とCALIタンパク質との融合タンパク質を作製したが、今年度はさらに試験管内分子進化手法でFRET効率の最適化を行った。特に、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質間の弱い相互作用に関与する部位周辺にランダム変異導入や部位飽和変異導入を行って作製したライブラリーからスクリーニングを行うことで良好なFRET効率を示す変異体を得た。キュベット中の蛍光分光測定により、この変異体は、FRETを介してCALIタンパク質の蛍光の光スイッチングが起こることを確認した。しかし、この融合タンパク質は、細胞内では十分な光スイッチングコントラストがなかったため、このタンパク質のさらなる特性改良を行っているところである。次年度は、良好な特性を持つ光スイッチングCALIタンパク質を完成させるとともに、SR-CALIの実験的検証を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、SR-CALIのコンセプトの実証に向けて、SR-CALIタンパク質の完成を目指すとともに、SR-CALI蛍光顕微鏡の製作とSR-CALIの実験的実証を行う。今年度作製した光スイッチング蛍光タンパク質とCALIタンパク質との融合タンパク質は、in vitroにおいて光スイッチングが起こることを確認済みであるため、これをテンプレートとして試験管内分子進化により特性改良を行い、SR-CALIタンパク質としての完成を目指す。SR-CALI蛍光顕微鏡としては、超解像顕微鏡法の一種で、ドーナツ光によって励起範囲を光の回折限界以下に限定するRESOLFT（reversible saturable optical fluorescence transitions）の照明法を応用したものを開発する。この蛍光顕微鏡では、照明光学系にVortex位相板を導入することでドーナツ光を発生させる。無細胞実験系におけるSR-CALIの実証には、SR-CALIタンパク質と蛍光色素を固定化したガラス基板の系を用いる。SR-CALIタンパク質を励起して発生した活性酸素種でその周囲の蛍光分子を破壊させて、SR-CALIタンパク質励起後に残存している蛍光分子を超解像イメージングで可視化することで、SR-CALIの空間分解能を解析する。培養細胞系におけるSR-CALIでは、SR-CALIタンパク質を発現させた培養細胞を調製し、SR-CALI蛍光顕微鏡下でSR-CALIを実施し、細胞内小器官やタンパク質複合体の光照射分子不活性化を検証する。
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