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Native mass spectrometry of membrane proteins obtained from cultured cells

Research Project

Project/Area Number 21K19236
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research InstitutionYokohama City University

Principal Investigator

明石 知子  横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)

Project Period (FY) 2021-07-09 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Keywords膜タンパク質 / ネイティブ質量分析 / タンパク質複合体
Outline of Research at the Start

現在利用されている低分子の薬剤のおよそ3割が、膜タンパク質であるG-protein coupled receptor(GPCR)をターゲットとしていると言われている。そのためGPCRと薬物複合体の構造解析や結合親和性の解析は、創薬を進めるにおいて重要な位置づけにある。本研究では、膜タンパク質の中でも不安定なGPCRに対して、特異的に結合する薬剤候補化合物を迅速に見出すための手法としてネイティブ質量分析を用いた実験手法を構築することを目指す。精製されミセル化されたGPCRでの実験系を構築した後、膜画分でミセル化していない未精製GPCRでの実験系の構築を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

本課題の最終目標は、膜タンパク質を大量発現系で調製後、精製せずに膜に結合したままの状態で取り上げ、候補化合物との結合の解析を行うための高スループットなネイティブ質量分析(MS)による実験系の構築である。それには高純度の試料で、従来法で問題なく実験が行えるサンプルであることを確認する必要がある。そこで、昨年度までに、精製した2つの膜タンパク質(大腸菌および海洋性細菌由来膜内亜鉛メタロプロテアーゼRseP、ヒトβ2型アドレナリン受容体β2AR)について、ネイティブ質量分析を行うための条件をほぼ確立し、従来法でイオンが観測できることを確認した。この結果をもとに、新たにケモカインIL-8の受容体CXCR1の阻害剤のスクリーニング系の構築を視野に、まずIL-8とCXCR1の複合体の観測を試みた。IL-8は大腸菌の発現系で、CXCR1は昆虫細胞の発現系で調製し、実験に供した。IL-8とCXCR1の結合界面は広いことから、安定な複合体の観測を期待して実験を行った。IL-8を発現・精製後、IL-8は単独では基本的に二量体で存在していることをネイティブ質量分析で確認した。このIL-8をCXCR1の精製時には共存させ、不安定なCXCR1の安定化に努めて調製した。しかしながら、CXCR1の安定性が予想以上に低く、これまでIL-8とCXCR1での複合体のイオンの観測には成功していない。
また、RsePを単離精製後、生体膜環境により近いリポソームに組み込み、ネイティブMSで観測する実験に着手した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GPCRは試料調製において発現量が少ないうえに扱いが難しく、実験にてこずっているため。

Strategy for Future Research Activity

扱っている膜タンパク質の中で、比較的安定なRsePについて、未精製の状態で取り上げてネイティブ質量分析を行うことを試みる。このRsePについてはリポソームに組み込む実験もさらに進める。IL-8とCXCR1の複合体の観測では、より安定化させるminiGタンパク質との三者複合体で安定に試料調製できること、そしてそのネイティブMSの実験が行える実験系を確立する。

Report

(3 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • 2021 Research-status Report
  • Research Products

    (34 results)

All 2024 2023 2022 2021

All Journal Article (8 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 6 results,  Open Access: 5 results) Presentation (26 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] Solvent effect on the detection of peptides and proteins by nanoelectrospray ionization mass spectrometry: Anomalous behavior of aqueous 2-propanol2024

    • Author(s)
      Ninomiya Satoshi、Rankin-Turner Stephanie、Akashi Satoko、Hiraoka Kenzo
    • Journal Title

      Analytical Biochemistry

      Volume: 688 Pages: 115461-115461

    • DOI

      10.1016/j.ab.2024.115461

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    • Author(s)
      Tajiri Michiko、Imai Shunsuke、Konuma Tsuyoshi、Shimamoto Keiko、Shimada Ichio、Akashi Satoko
    • Journal Title

      ACS Omega

      Volume: 8 Issue: 27 Pages: 24544-24551

    • DOI

      10.1021/acsomega.3c02737

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    • Author(s)
      Ishimoto Naito、Park Jae-Hyun、Kawakami Kouki、Tajiri Michiko、Mizutani Kenji、Akashi Satoko、Tame Jeremy R. H.、Inoue Asuka、Park Sam-Yong
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 14 Issue: 1 Pages: 4107-4107

    • DOI

      10.1038/s41467-023-39799-2

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    • Author(s)
      Liu, N, Konuma, T, Sharma, R, Wang, D, Zhao, N, Cao, L, Ju, Y, Liu, D, Wang, S, Bosch, A, Sun, Y, Zhang, S, Ji, D, Nagatoishi, S, Suzuki, N, Kikuchi, M, Wakamori, M, Zhao, C, Ren, C, Zhou, TJ, Xu, Y, Meslamani, J, Fu, S, Umehara, T, Tsumoto, K, Akashi, S, Zeng, L, Roeder, RG, Walsh, MJ, Zhang, Q, Zhou, MM
    • Journal Title

      Molecular Cell

      Volume: 83 Issue: 13 Pages: 2206-2221.e11

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2023.05.022

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      Azegami Nanako、Taguchi Rina、Suzuki Noa、Sakata Yusuke、Konuma Tsuyoshi、Akashi Satoko
    • Journal Title

      Mass Spectrometry

      Volume: 11 Issue: 1 Pages: A0110-A0110

    • DOI

      10.5702/massspectrometry.A0110

    • ISSN
      2186-5116, 2187-137X
    • Year and Date
      2022-12-28
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      Volume: 8 Issue: 34

    • DOI

      10.1126/sciadv.abp9011

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      Tanaka Tsubasa、Ekimoto Toru、Nagatomo Meri、Neyazaki Makiko、Shimoji Erena、Yamane Tsutomu、Kanagawa Sakura、Oi Rika、Mihara Emiko、Takagi Junichi、Akashi Satoko、Ikeguchi Mitsunori、Nogi Terukazu
    • Journal Title

      Protein Science

      Volume: 31 Issue: 11

    • DOI

      10.1002/pro.4452

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      Imaizumi Yuki, Yokoyama Tatsuhiko et al., (23人中11番目)
    • Journal Title

      bioRxiv

      Volume: -

    • DOI

      10.1101/2022.01.31.478169

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Published: 2021-07-13   Modified: 2024-12-25  

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