非アルコール性脂肪性肝疾患の治療に資するホスホリパーゼCの解明
| Project/Area Number |
21K19327
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
河野 望 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (50451852)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | ホスホリパーゼC / ホスファチジルイノシトール / 非アルコール性脂肪性肝疾患 |
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| Outline of Research at the Start |
LPIAT1を欠損したHuh-7細胞においてみられるPIの顕著な分解を担う分子を、PLC活性やその類縁活性を担う分子のsiRNAと阻害剤による機能阻害実験により探索する。また安定同位体ラベルされたアラキドン酸含有PIとオレイン酸含有PIを用いたin vitroのPI-PLCアッセイを用いて、PI-PLC の候補分子の中からオレイン酸含有PI 特異的にPLC 活性を発揮する分子を探索する。必要に応じて、本アッセイを指標としてPI-PLC の精製、同定を試みる。同定したPLC 分子に関して、肝特異的LPIAT1 欠損マウスに対してノックダウンをおこない、脂肪肝の発症が抑制されるか検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
LPIAT1を欠損したHuh-7細胞は、LPIAT1欠損マウス肝臓と同様にアラキドン酸含有PI の減少とオレイン酸含有PI の増加、中性脂質の蓄積がみられる。この細胞に[14C]グリセロールを添加し、[14C]ラベルされたPI の分解を経時的に調べると、LPIAT1 KO 細胞では野生型に比べてPI の分解が顕著に亢進した。このLPIAT1欠損によるPI分解の亢進はマウス肝臓においてもみられ、分解産物の追跡から、PLC様の酵素が働いていることが示唆されている。本年度は細胞レベルでのPI 分解アッセイを利用して、各種阻害剤を添加し、PI分解を抑制する化合物をスクリーニングした。その結果、PLCの一般的な阻害剤であるU73122やリソソームの酸性化を抑制するクロロキンではLPIAT1 KO 細胞におけるPI分解の亢進を抑制できなかった。一方で、脂質のホスファターゼを抑制する阻害剤の1つがLPIAT1 KO 細胞におけるPI分解の亢進を抑制することを見出した。またLPIAT1 KO 細胞におけるPI分解の亢進において、分解されるPIに分子種特異性があるか調べるために、d8グリセロールラベルによる標識PIのLC-MSでの検出系を検討した。d8グリセロールの添加条件、LC条件、MRM条件を決定し、48時間のd8グリセロールラベルで10-15%のPIをラベルし、それらの逆相カラムを用いたLC-MS/MSにより個々に検出・定量することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究室で起きた火災のため研究機器・試薬の使用が制限され、計画していたRNAi実験の一部とクリックケミストリーを用いたPI分解の可視化の実験ができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、候補分子のRNAi実験と阻害剤の実験をおこない、LPIAT1 KO細胞でPIの分解を担う分子の同定を目指す。またd8グリセロールを用いたPI分解アッセイを立ち上げ、分解酵素のPI分子種特異性を検証する。さらにクリックケミストリーを用いたPIの分解を可視化する方法を導入し、網羅的なスクリーニングを行う準備をする。
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Report
(2 results)
Research Products
(35 results)
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[Journal Article] Abnormal male reproduction and embryonic development induced by downregulation of a phospholipid fatty acid-introducing enzyme Lpgat1 in zebrafish2022
Author(s)
Shibata T, Kawana H, Nishino Y, Ito Y, Sato H, Onishi H, Kano K, Inoue A, Taketomi Y, Murakami M, Kofuji S, Nishina H, Miyazawa A, Kono N, Aoki J.
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Journal Title
Scientific reports
Volume: 12
Issue: 1
Pages: 7312-7312
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Hypercholesterolemic Dysregulation of Calpain in Lymphatic Endothelial Cells Interferes With Regulatory T-Cell Stability and Trafficking.2022
Author(s)
T. Miyazaki, Y. Taketomi, T. Higashi, H. Ohtaki, T. Takaki, K. Ohnishi, M. Hosonuma, N. Kono, R. Akasu, S. Haraguchi, JR. Kim-Kaneyama, K. Otsu, H. Arai, M. Murakami, A. Miyazaki
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Journal Title
Arterioscler Thromb Vasc Biol.
Volume: 43
Issue: 2
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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