| Project/Area Number |
21K19418
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 50:Oncology and related fields
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
仙波 憲太郎 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (70206663)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 信元 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 嘱託職員 (90221689)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 細胞間相互作用 / 化合物スクリーニング / 細胞運動 / 質量分析 / 細胞間作用 / 発がん / ケミカルバイオロジー / がん / ケミカルスクリーニング |
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| Outline of Research at the Start |
がん細胞は、周囲の正常細胞によって増殖抑制を受けたり、物理的に排除されたりする。我々は、この発がんの初期過程を模倣する実験系を用いた化合物スクリーニングにより、正常細胞が持つ「がん防御機構」を強化する化合物を３種得た。これらについて、高活性化合物の取得、化合物結合タンパク質や標的シグナル経路の同定を行うことによって、正常細胞ーがん細胞間作用に基づくがん防御機構の破綻メカニズムを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞のまわりを取り囲む正常細胞はがん細胞の増殖とその領域拡大を抑制するが、この機能が損なわれると、がん細胞は正常な組織を破壊しながら増殖を続け、腫瘍を形成するようになる。我々は、KRAS発現細胞（がん細胞モデル）と正常細胞との混合培養系を用いて、正常細胞のもつこの機能を強化する化合物のスクリーニングを行った。この混合培養系では、がん細胞は増殖して、細胞塊（フォーカス）を形成する。このスクリーニングでは、フォーカスの大きさと数の変化を評価した。化合物スクリーニングの結果、ロニダミン（LND）、ドンペリドン（DPD）を含む3つのヒット化合物が、がん細胞によるフォーカス形成を抑制することを見出した。23年度は、 (1)ヒット化合物の標的タンパク質同定にむけた質量分析による解析、(2) 第3の化合物の機能解析、(3)炎症との関連についての解析、を進めた。結果：(1) LND結合ビーズを用いた相対定量質量分析により、約4000の候補タンパク質を得た。これらのうち、複合体を形成する複数のタンパク質が同定されたものに着目して、LNDビーズとの結合を確認した。次に、LNDに結合するタンパク質のうちの一つを指令する遺伝子をノックダウンしたところ、LNDによるフォーカス形成抑制活性が消失した。このことから、LNDはこのタンパク質を介してフォーカス形成を抑制する可能性が考えられた。(2)第3の化合物によるシグナル伝達経路の変化を調べたところ、この化合物はJNKのリン酸化を抑制することを見出した。(3)炎症反応はがん細胞の増殖に促進的に働くが、この混合培養系においても炎症反応を起こさせると、フォーカスが拡大する、すなわち悪化する方向に進むことが見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)正常細胞の細胞抽出液とLNDを固定化した磁気ビーズ(LNDビーズ)を用いた結合実験により、LND結合タンパク質を精製した。これをnano LC-MS/MSの相対定量システムで質量分析し、LNDに結合する候補として約4000の候補タンパク質を得た。さらに候補タンパク質間の相互作用を解析し、細胞増殖や細胞運動を制御するタンパク質群を見出した。このタンパク質群のうち、LNDと特異的に結合するタンパク質をノックダウン実験により減少させると、LNDによるフォーカス抑制効果が消失した。このことは、このタンパク質がLNDの作用点となる重要なタンパク質である可能性を強く示唆する結果である。
(2)第3の化合物が正常細胞のJNK経路を変化させる一方で、KRAS発現細胞には変化を及ぼさないし、その増殖にも関与していないことから、正常細胞におけるJNK経路に着目するに至った。
(3) 樹立した混合培養系が、炎症によるがんの悪性化を評価するモデルとなるかどうかを検討したところ、LPS刺激によりフォーカスが拡大することが観察された。このとき、LPSはKRAS発現細胞の増殖に直接的に働いていないことを確認した。
以上のように、23年度は今後につながる成果が得られたことから、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
新型コロナウイルスの感染拡大により、大学では長期の研究室の閉鎖を経験した。結果として、研究は遅延し、24年度に延長申請を行った。24年度は以下の検討を進めることで、がん細胞の正常細胞領域への拡大を阻止する機構への理解を深め、これまでの成果を論文としてまとめ、新規がん治療戦略への研究への礎としたい。
(1)有力なLND結合タンパク質が得られたことから、LNDが当該タンパク質を含むタンパク質複合体の活性にどのような影響を及ぼすかを解析する。具体的には、①in vitroでの活性評価系を確立し、LNDの添加により活性の変化を調べる。②シグナル経路上、このタンパク質複合体の下流のタンパク質に着目して、LNDを細胞に添加することでその下流タンパク質への効果を調べる。③LNDと当該タンパク質のどこに結合するかをドッキングシミュレーションにより推定し、続いて結合推定部位に変異を導入することで、その推定の妥当性を検証する。(2)第3の化合物について、JNK遺伝子のノックダウン細胞を樹立し、フォーカス形成抑制活性におけるJNK経路の重要性を検討する。(3)LPSによる刺激が正常細胞のフォーカス形成抑制活性を減弱させることから、LPSとLNDは反対の効果をもつと言える。そこで、両化合物がどのようなタンパク質やシグナル経路を介して作用するのかを、特に炎症のシグナル経路に着目して解析を進める。
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