| Project/Area Number |
21K19527
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 55:Surgery of the organs maintaining homeostasis and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
MIYAGAWA Shuji 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | CISPR/Cas3 / Knockout / GGTA1 / PERV-C / Xenotransplantation / PERV / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞 / CMAH / Hanganutziu-Deicher抗原 / ブタ内在性レトロウイルス / 再生医療 / バイオ人工臓器 / ノックアウト / CRISPR |
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| Outline of Research at the Start |
バイオ人工臓器（異種移植）の分野では、当初、相同組み替え法は困難を極めたが、新法によるknockout（KO）法が我々も含めブタでも成功している。しかし、CRISPR/Cas9法には特許の問題が絡んでおり、今回研究協力者の真下知士グループが開発したCRISPR/Cas3法を応用してKO-ブタの作出を進める。現時点でブタ細胞での有効性はまだ確立されていない。ブタの繊維芽細胞、等を使って、先ずはこのCas3法で既にCas9法でKO経験のあるブタGalTと4GalNT2のKOを比較しながら行う。次に、SLA ClassI,II、とPERV(内在性レトロウイルス)-CのKOの有効性の検証を行う。
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| Outline of Final Research Achievements |
In order to apply the CISPR/Cas3 method to pig cells, we attempted knockout (KO) of GGTA1 and porcine endogenous retrovirus (PERV)-C.
Focusing on exon 9 of GGTA1, we prepared target plasmids and introduced them into pig fibroblast cells. First, the expression of Gal-epitope was analyzed by FACS, and then nested PCR was performed. Furthermore, the PCR products of each group were transformed into E. coli, and a large number of colonies were checked by PCR, Sanger method . The results demonstrated a deletion of 294-754bp was produced in GGTA1 gene.
Next, we focused on PERV-C and attempted to KO it using just the same as the Cas3 method for GGTA1. However, it was not possible to analyze the deletion of PERV-C in E.coli colonies, because of sit number of PERV. However, in conclusion, we confirmed the effectiveness and feature of the CRISPR/Cas3 method in xenotransplantation.
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| Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements |
この研究で、異種移植分野の（ブタを使った）臓器開発での遺伝子のtargeting法で、一般に普及しているCRISPR/Cas9を使わずに、日本で開発されている新たな方法であるCRISPR/Cas3を使うことが可能になれば、特許の問題を気にせずに遺伝子編集が可能になる。これは単に異種移植分野だけでなく、他の医学・畜産、等の分野に大きく影響をもたらす。
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