| Project/Area Number |
21K19570
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 56:Surgery related to the biological and sensory functions and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
辻川 元一 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70419472)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋山 雅人 九州大学, 医学研究院, 講師 (10757686)
佐藤 茂 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (70738525)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 器官発生 / オルガノイド / iPS細胞 / 眼分化 / ヒトiPS細胞 / 眼科学 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒトiPS株に、ランダムミュータジェネシスを科学変異物質ENUを用いて、導入し,
ヒト眼オルガノイドであるSEAMを用いて、その形態の異常を指標として異常株の選択を行う。これに対して、ゲノム解析を行い、候補変異を同定する。これらを、ゼブラフィッシュを用いた、遺伝子操作技術により、候補変異の昨日十その正当性を実証しつつ、iPS細胞に対しても、CRSPRを用いた方法により、変異の再現をとることで、候補遺伝子を決定する。これにより、複数の眼発生に必要な遺伝子を同定することで、がん発生に関わるシグナル経路の同定を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの眼の発生機構については不明な点が多い。これは発生系譜の異なる多くの組織が集合して形成される器官のモデルが存在せず、発生期の各組織の相互作用のあり方が不明であることが原因である。我々はヒトiPS細胞から眼に関する組織の原基すべてが発生し、さらに、それが自律的に同心円状の構造を形成するSEAM法という誘導法を開発した。SEAMは発生系譜が異なる各組織が秩序だって整列する眼器官形成のモデルであるといえる。第1層は中枢神経、第二層は網膜、第三層は角膜上皮、第四層は皮膚上皮であり、第三層付近に神経堤が発生してくる。我々はこのSEAM形成を指標とした眼の発生を対象としたForward Genetics
Screeningにより、眼の発生に関わる分子の網羅的な検討を通して、現在不明である眼形成における分子（シグナル）経路を明らかにしていく。
本年度までに標準的iPS細胞株である201B7株に対して科学変異物質ENUを用いて全ゲノム上にランダムに点変異を導入する、ランダムミュータジェネシスを行った。ENUは強力な変異誘導物質であり、iPS細胞を死滅させるため、バイアビリティが落ちつつも、単細胞からスフェアを回復できるような条件を検討した。
その結果としての条件決定を行ったのと同時に、その際のプレリミナリーな導入を行った株に対して、てヒト眼オルガノイドであるSEAMを誘導し、その形態の異常を指標として異常株の選択を行うことができた。その中の一つに第2層に異常が認められる株を単離することができた。これに対して、全ゲノムシークエンス、および、誘導時期におけるｍRNAseqを行った。これによりいくつかの候補遺伝子を得た.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由
第2層に異常が認められる一株について、全ゲノムシークエンスを行った。これにより、正常B7株をリファレンスとした変異を100以上同定した。
また、この株の眼誘導・発生時期、2次期におけるｍRNA seqも使用し、その二つの結果より、候補遺伝子の選定を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補遺伝子に対して、オルガノイド上の時空間的発現の検討、および、アノテーションされている遺伝子の機能からさらに、候補遺伝子を絞る
また、iPS細胞上でCRSPRによるノックアウト、および、過剰発現を行うことにより、表現型を再現することを目的とする。
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