| Project/Area Number |
21K19571
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 56:Surgery related to the biological and sensory functions and related fields
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
秋末 敏宏 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (90379363)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河本 旭哉 神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 医学研究員 (30420558)
竹森 俊幸 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (20884456)
原 仁美 神戸大学, 医学研究科, 助教 (40437489)
深瀬 直政 神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 特命助教 (60579324)
藤原 周一 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (50909710)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 肉腫 / 細胞内小器官 / 相分離 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、骨や筋肉などに発生する悪性腫瘍（肉腫）における液-液相分離と膜を持たない細胞内小器官に関する研究の手始めとして、肉腫細胞でのストレス顆粒に関する基礎的メカニズムおよび関連因子と臨床像の相関を検討することを目的としている。実験は、肉腫細胞株におけるストレス顆粒関連遺伝子・蛋白発現解析および低酸素刺激によるストレス顆粒関連遺伝子・蛋白発現解析を行う。さらに、肉腫細胞株におけるストレス顆粒の生成とストレス顆粒内のRNAおよび蛋白発現の網羅的解析を行い、その結果、コントロール群とストレス刺激群間に有意差のあった遺伝子発現について臨床検体での解析も行い、生命予後などの臨床情報との比較を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度（令和５年度）においては、骨肉腫細胞株MG63、KHOS、LM8、SaOS2中のストレス顆粒関連タンパク質(TIA-1、TIAR、G3BP1、G3BP2、CAPRIN-1、USP10)の
発現の有無をウェスタンブロットで再評価した。その結果、これらの細胞株で普通の培養下でストレス顆粒タンパク質が発現していることを再度確認した。また、ストレス顆粒関連タンパク質について、in vitroで各細胞株において蛍光免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で発現と局在を調べる。更にin vitroで低酸素環境下（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）のストレス顆粒タンパク質の遺伝子・タンパク質レベルでの発現の確認を開始した。
これらの細胞株のうちMG63にレトロウイルスを用いてOCT3/4、KLF4,SOX2を導入し、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSを作製した。MG-OKSの網羅的遺伝子解析でMG-63に比し有意な発現上昇を認めた遺伝子から、がん関連の報告があるSPRR1Aに着目し、in vitroにてMG-OKSにSPRR1A選択的siRNAを導入し(siMG-OKS)、SPRR1Aの発現をqRT-PCRで確認し、細胞形態を位相差顕微鏡で観察した。細胞増殖能をWST-8 assayでMG-OKSとsiMG-OKSで比較検討した。結果は、qRT-PCRにてsiMG-OKSでSPRR1Aの発現低下を確認した。siMG-OKSはMG-OKSと比較し細胞増殖能が有意に低下していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2023年度（令和５年度）においては、前年度までの実験結果の再現性を確認した。また、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSを作製し、がん関連の報告があるSPRR1Aに着目し、さらに、本遺伝子の発現抑制の細胞形態と細胞増殖能への影響を検討し、肉腫細胞における膜を持たない細胞内小器官へのSPRR1Aの関与を検討した。研究計画はやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度（令和６年度）においては、前年度までの実験で発現が確認できているストレス顆粒関連タンパク質について、in vitroで各細胞株において蛍光免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で発現と局在を調べる。更にin vitroで低酸素環境下（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）のストレス顆粒タンパク質の遺伝子・タンパク質レベルでの発現の確認を行い、両群を比較検討する。また、低酸素環境下と通常培養での各々の群の細胞を回収しRNAシーケンスあるいはプロテオトーム解析など網羅的な手法を用いて解析する。さらに、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSにおける膜を持たない細胞内小器官に関連するストレス顆粒関連タンパク質の発現を検討する。
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