一細胞CRISPRスクリーニング法を駆使した機能的GWAS-SNP検出法の確立

• Project/Area Number: 21K19589
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80788422)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡田 寛之 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (10883481) ; 大庭 伸介 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20466733) ; 関 真秀 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任准教授 (90749326)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: CRISPRスクリーニング / 一細胞解析 / SNP / エンハンサー / CRISPR / 一細胞CRISPRスクリーニング

Outline of Research at the Start

近年、人の遺伝病や癌を対象としたゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study；GWAS）が活発に行われ、疾患との関連が示唆される一塩基多型（SNP）のビックデータが蓄積しつつあります。一方で、推測された候補SNPの生物学的な検証のためには、時間と労力を要するバイオアッセイが必要であり、GWAS-SNP解析全体の大きなボトルネックとなっています。本研究では、ゲノム編集と一細胞RNA-seqを統合することで、機能的なSNPを効率よく選別する新規手法の開発を行います。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、SNPスクリーニングの実施のために、ガイドRNA (gRNA)レンチウイルスライブラリーとCRISPRレポータ細胞の作製に取り掛かった。まず、複数のガイドRNAを同時に発現可能なgRNA発現ライブラリーの検討を行った。次に挙げる理由から、Cas9システムだけでなくCas12システムも検討した。Cas9システムでは、CRISPR活性を発揮するためにはtracrRNAと crRNAの２種類のRNAが必要であるのに対して、Cas12システムでは5crRNAのみで機能を発揮するため、より単純なベクター構成が可能である。Cas12システムでは複数のgRNAを並列に配置することが可能なため、複数エンハンサー・SNP活性の同時制御が可能であると考えた。スクリーニング用のバーコードが検出可能なように、複数のgRNA配列と同時にバーコード配列が転写されるシステムを採用した。骨芽細胞の分化に関わる転写因子群を制御する複数のエンハンサーに対してgRNAを設計し、その機能を確認した。
次に、間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を蛍光タンパク質でモニタリング可能な細胞株の樹立に着手した。まず、間葉系幹細胞を株化するため、ヒトTERT1遺伝子をレンチウイルスで感染させたのち、薬剤耐性遺伝子を用いたセレクションを行い、間葉系幹細胞株を得た。次に、骨芽細胞分化マーカーの転写制御領域と蛍光タンパク質をコードする融合遺伝子をゲノムにノックインする実験に着手した。Cas9システムを用いて、融合遺伝子をヒトゲノムのセーフハーバー領域にノックインした。現在、薬剤セレクション・シングルセルクローニングを進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画通り、gRNAライブラリーの構築やレポータ細胞の樹立が進んでいるから。

Strategy for Future Research Activity

樹立した細胞を用いたエンハンサースクリーニングを実施する

Research Products

• [Journal Article] Stem cell-based modeling and single-cell multiomics reveal gene-regulatory mechanisms underlying human skeletal development (2023)
  • Author(s): Tani Shoichiro, Okada Hiroyuki, Onodera Shoko, Chijimatsu Ryota, Seki Masahide, Suzuki Yutaka, Xin Xiaonan, Rowe David W., Saito Taku, Tanaka Sakae, Chung Ung-il, Ohba Shinsuke, Hojo Hironori
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 42 Issue: 4 Pages: 112276-112276
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112276
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Single-cell RNA sequencing unravels heterogeneity of skeletal progenitors and cell-cell interactions underlying the bone repair process (2022)
  • Author(s): Nakayama Mika、Okada Hiroyuki、Seki Masahide、Suzuki Yutaka、Chung Ung-il、Ohba Shinsuke、Hojo Hironori
  • Journal Title: Regenerative Therapy Volume: 21 Pages: 9-18
  • DOI: 10.1016/j.reth.2022.05.001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Runx2 regulates chromatin accessibility to direct the osteoblast program at neonatal stages (2022)
  • Author(s): Hojo Hironori, Saito Taku, He Xinjun, Guo Qiuyu, Onodera Shoko, Azuma Toshifumi, Koebis Michinori, Nakao Kazuki, Aiba Atsu, Seki Masahide, Suzuki Yutaka, Okada Hiroyuki, Tanaka Sakae, Chung Ung-il, McMahon Andrew P., Ohba Shinsuke
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 40 Issue: 10 Pages: 111315-111315
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111315
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Involvement of activator protein-1 family members in β-catenin and p300 association on the genome of PANC-1 cells (2022)
  • Author(s): Doi Tomomitsu、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke、Obayashi Kunie、Endo Motoyoshi、Ishizaki Toshimasa、Katoh Akira、Kouji Hiroyuki
  • Journal Title: Heliyon Volume: 8 Issue: 2 Pages: e08890-e08890
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2022.e08890
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A neomorphic variant in SP7 alters sequence specificity and causes a high-turnover bone disorder (2022)
  • Author(s): Lui Julian C.、Raimann Adalbert、Hojo Hironori、Dong Lijin、Roschger Paul、Kikani Bijal、Wintergerst Uwe、Fratzl-Zelman Nadja、Jee Youn Hee、Haeusler Gabriele、Baron Jeffrey
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 700-700
  • DOI: 10.1038/s41467-022-28318-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin (2021)
  • Author(s): Wang JS, Kamath T, Mazur CM, Mirzamohammadi F, Rotter D, Hojo H, Castro CD, Tokavanich N, Patel R, Govea N, Enishi T, Wu Y, da Silva Martins J, Bruce M, Brooks DJ, Bouxsein ML, Tokarz D, Lin CP, Abdul A, Macosko EZ, Fiscaletti M, Munns CF, Ryder P, Kost-Alimova M, Byrne P, Cimini B, Fujiwara M, Kronenberg HM, Wein MN.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 6271-6271
  • DOI: 10.1038/s41467-021-26571-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Induction and expansion of human PRRX1+ limb-bud-like mesenchymal cells from pluripotent stem cells (2021)
  • Author(s): Yamada Daisuke、Nakamura Masahiro、Takao Tomoka、Takihira Shota、Yoshida Aki、Kawai Shunsuke、Miura Akihiro、Ming Lu、Yoshitomi Hiroyuki、Gozu Mai、Okamoto Kumi、Hojo Hironori、Kusaka Naoyuki、Iwai Ryosuke、Nakata Eiji、Ozaki Toshifumi、Toguchida Junya、Takarada Takeshi
  • Journal Title: Nature Biomedical Engineering Volume: 5 Issue: 8 Pages: 926-940
  • DOI: 10.1038/s41551-021-00778-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mesenchymal stromal cells in the bone marrow niche consist of multi-populations with distinct transcriptional and epigenetic properties (2021)
  • Author(s): Kanazawa Sanshiro、Okada Hiroyuki、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke、Iwata Junichi、Komura Makoto、Hikita Atsuhiko、Hoshi Kazuto
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 15811-15811
  • DOI: 10.1038/s41598-021-94186-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] "Gene regulatory networks underlying human endochondral bone formation " (2022)
  • Author(s): Shoichiro Tani, Hiroyuki Okada, Taku Saito, Sakae Tanaka, Ung-il Chung, Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
  • Organizer: ICORS 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Understanding a mechanism underlying bone repair process and application for bone regeneration (2021)
  • Author(s): Hironori Hojo
  • Organizer: SICEM 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 骨格形成における遺伝子制御ランドスケープの解明 (2021)
  • Author(s): 北條宏徳
  • Organizer: 17th Meeting of Bone Biology Forum
  • Invited