| Project/Area Number |
21K19609
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
自見 英治郎 九州大学, 歯学研究院, 教授 (40276598)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清島 保 九州大学, 歯学研究院, 教授 (20264054)
片桐 岳信 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (80245802)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
|
|---|
| Keywords | 脱アミド化 / 口腔扁平上皮癌 / NF-κB / NF-kB |
|---|
| Outline of Research at the Start |
p65の脱アミド化部位（N64D, N139D）を特異的に認識する抗体を作製し、口腔扁平上皮癌患者の病理組織切片を用いて、CADと脱アミド化p65の局在を比較解析し、臨床病理学的検討を行う。野生型および脱アミド化p65変異体を発現する細胞株を樹立し、脱アミド化依存性の遺伝子発現をRNA-seq法で網羅的に解析する。さらに、我々が確立したは顎骨浸潤モデル、および肺転移モデルを用いて、p65の脱アミド化による浸潤と転移における役割を解析する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の機能は、立体構造の変化によって調節される。特定アミノ酸残基のリン酸化やアセチル化、アミド化などの翻訳後修飾は、重要なタンパク質の機能調節系である。タンパク質のアミド基を取り除く脱アミド化反応は、長い間、徐々に進行する酵素に依存しない「 化」と考えられてきた。しかし、ある種の免 疫系タンパク質の短時間に起こる脱アミド化が、がん細胞や微生物による免疫回避に重要な役割を果たす、という新たなモデルが提唱された。近年、転写因子NF-κBのメインサブユニットであるp65の64番目および139番目のアスパラギン（N）が脱アミド化（アスパラギン酸へ変異：D）することが報告されたが、その機能は不明な点が多い。まず、p65の脱アミド化部位（N64D, N139D）を含むペプチドを抗原として、脱アミド化p65 を特異的に認識する抗体を作製した。N64Dに対する抗体は特異性が著しく低く作製できなかったが、N139Dに対する抗体を得ることができた。しかし、N139Dだけでなく野生型p65も認識してしまうので、現在抗体の希釈濃度を検討中である。FLAG TagおよびGFPを融合したp65変異体（N64D, N139D, および2つの変異を持つDD）を作製して転写活性を調べた。N64Dは野生型と殆ど変化しなかったが、N139Dは転写活性が40%まで低下した。DDは転写活性が25%まで低下したが、DD変異体の発現そのものが著しく低下しており、DDの転写活性の低下は発現量の低下に起因すると考えられた。現在、２種類のマウスがん細胞（SCCVII細胞、およびB16細胞）の内在性のp65をゲノム編集でノックアウトし、野生型およびp65変異体を恒常的に発現する細胞株を樹立中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍により本研究に従事する中国人留学生の来日が予定より大幅に遅れたことで実験開始が遅くなった。またCRISPR-Cas9を使ってマウスがん細胞の内在性のp65をノックアウトすることを試みているが、遺伝子導入効率が悪くクローン化に時間を要している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. N64D, N139D, およびDDを恒常的に発現する細胞株の樹立：現在進行中である。
2. マウス右下顎角から1.で樹立した細胞株の移植と顎骨浸潤および肺転移の検討：SCCVII細胞はC3H/HeNマウスに、B16細胞はB6マウス右下顎角から移植し、経時的な腫瘍の増殖を検討する。さらに移植４週間後に生存率、μCT撮影のよる骨破壊の程度の解析、開腹による肺（その他臓器）転移の有無を確認する。下顎骨および肺の組織切片を作製し、H&E染色、Ki-67染色、破骨細胞を検出するTRAP染色を行い、組織学的解析を行う。
3.変異体の顎骨浸潤および肺転移に関する分子機構の解明：各変異体と会合する分子を網羅的に解析する。シグナル伝達経路の解析とともに、データベースおよび文献情報をもとに重要と思われる分子に着目し、p65との会合を検討する。がん細胞は好気性環境下でも解糖系への依存が高いことから樹立した細胞株の解糖系および電子伝達系でのATP産生を検討する。
|
