| Project/Area Number |
21K19701
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 59:Sports sciences, physical education, health sciences, and related fields
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
飯田 薫子 お茶の水女子大学, 基幹研究院, 教授 (50375458)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | 慢性腎臓病 / インドキシル硫酸 / 芳香族炭化水素受容体 / 尿毒症性サルコペニア / クリシン / 腎不全 / 筋萎縮 / ポリフェノール / フラボノイド |
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| Outline of Research at the Start |
日本では成人の約8人に1人が慢性腎臓病(CKD)と推計される。CKDが進行すると筋萎縮や筋力の低下が生じて寝たきりリスクが高まることが知られ、その対策が必須である。そこで本研究では、CKDで生じる尿毒症物質の一種であるインドキシル硫酸の生体障害に着目した。インドキシル硫酸は芳香族炭化水素受容体(AhR)に結合して様々な生体作用を発揮する。一方近年、複数のポリフェノールがAhRと結合し、その作用を抑制することが報告されてきた。そこで本研究ではAhRの作用を抑制し、筋萎縮に防御的に働く食品由来ポリフェノールを同定し、尿毒症性サルコペニア予防のための新たな食事療法の開発をめざす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性腎臓病(CKD)では病態が進行すると筋萎縮や筋力低下が生じるが、その発症機構は不明の点が多い。本研究では尿毒素の一種であるインドキシル硫酸（IS）と、ISが結合する芳香族炭化水素受容体AhRに着目し検討を行った。前年度に、血管内皮細胞HUVECにISを負荷するとAhRの標的遺伝子（CYP1A1, AhRR）の発現が上昇し、酸化ストレス産生や炎症関連遺伝子の発現が増強すること、食品ポリフェノールchrysin およびapigeninの処理によりこれらの遺伝子発現の上昇が抑制されることを確認した。一方で、筋芽細胞株C2C12ではこれらの作用が見られなかった。そこで本年度は以下の検討を行った。
１）C2C12細胞において、ISの影響をさらに詳細に検討した。筋分化や筋肥大・萎縮、代謝に関わるマーカー遺伝子やタンパク質の発現などを検討したが、IS投与ではこれらの因子に明らかな変化は認めなかった。
２）モデル動物を用い、細胞実験で最も効果の見られたchrysin の効果を確認した。片側の腎摘出を行なったマウスに継続的にISを腹腔内投与（100 mg/kgBW）することにより血中の有意なIS上昇と軽度の腎不全病態を呈する病態モデルを作成し、chrysin(50 mg/kgBW)を経口にて継続投与した。その結果、IS負荷群の腎組織でCYP1A1の発現が上昇し、糸球体を中心とした組織障害が生じること、chrysin投与群ではCYP1A1の発現は低下し、IS投与群で見られた腎組織病変が改善することを確認した。一方で、本モデルマウスの骨格筋組織ではAhRの標的遺伝子であるCYP1A1の上昇は認められるものの、筋萎縮などの組織変化や、筋萎縮関連マーカの変化は認められなかった。これは細胞を用いた検討とも一致した結果であった。このため筋組織に対するchrysinの効果については評価できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、細胞や病態モデルマウスを用い、腎臓及び骨格筋でのインドキシル硫酸(IS)によるAhR活性化とそれに伴う病的変化を明らかとするとともに、AhRの活性化制御を介して、これらの病的変化を抑制しうる食品因子の探索を行うことである。
本年度は、前年度に認められていた培養細胞を用いた実験系の結果について動物モデルを用いた検証を行った。その結果ISの血中濃度増加が腎臓においてAhRを活性化し、その標的遺伝子の発現を増加させ、糸球体を中心とする組織障害の原因となる可能性を明らかにした。さらに、食品ポリフェノールの１つであるchrysinがこれらの変化を軽減しうることを見出した。以上の結果については、現在、国際誌へ投稿中（査読中）である。一方でISの血中濃度が増加しても、筋組織での病的変化は認められなかった。
このように本年度は、これまでの細胞実験で得られた結果を動物実験で検証できた。その結果、食品ポリフェノールであるchrysinがISによる腎障害を改善しうる候補因子であることを確認し論文投稿に至ったことから、研究は概ね計画通りに進行していると考える。一方で細胞実験と同様に、ISは筋組織において明らかな効果を呈さないことが明らかとなったが、これについてはさらに長期投与などを行い、継続した検証が必要であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初、本課題の研究実施期間は3年の計画であったが、以下の追加検証が必要と考えられたため実施期間を延長し、以下の研究を推進していく。
・HUVECではISによる細胞障害性作用を、chrysin , apigenin, luteolinなどが抑制することを明らかとした。そこでレポーターアッセイを用いたAhR活性評価系を構築し、他にも同様の効果を示すポリフェノールの候補因子を探索する。具体的にはレポーター遺伝子をHUVECに導入してISと共に種々のポリフェノールを負荷し、レポーター活性を測定していく。
・動物実験においては、IS投与によって腎障害は生じたものの筋萎縮などの筋組織の病的変化は認められなかった。その一因として、ISは血管に主に作用する可能性が示唆されており、血管の豊富な腎組織においては比較的短期間で病変が認められるものの、筋組織では長期にISに暴露されなければ病的変化は生じない可能性が考えられた。そこで、IS投与期間をこれまでの１ヶ月から３ヶ月に延長して検討を行うこととする。さらに、細胞実験で効果の見られた、ApigeninおよびLuteolinの効果についても併せて検討を行う。具体的には、片腎切除したマウスにIS（100 mg/kgBW）を３ヶ月間腹腔内投与し、さらにポリフェノール投与群（chrysin, apigenin, luteolin）には候補ポリフェノールを継続的に経口投与する。腎臓と骨格筋組織について以下の項目を評価する。組織学的評価（HE染色、アザン染色、蛍光免疫染色）、AhR標的遺伝子、炎症・酸化ストレス関連遺伝子、線維化・筋萎縮関連マーカー遺伝子の発現検討、これらの反応に関わるシグナル分子の活性化評価(NFκB等)、細胞内活性酸素種(ROS )の定量など。
加えて、現在投稿中の論文の査読結果に応じて必要な追加実験をおこなっていく。
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