| Project/Area Number |
21K19846
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 63:Environmental analyses and evaluation and related fields
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
星 信彦 神戸大学, 農学研究科, 教授 (10209223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横山 俊史 神戸大学, 農学研究科, 助教 (10380156)
杉尾 翔太 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (30825344)
池中 良徳 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (40543509)
平野 哲史 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (70804590)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | ネオニコチノイド系農薬 / 二光子顕微鏡 / ミクログリア / クロチアニジン / Ca2+イメージング / 第一次体性感覚野（S1） / 海馬 / α7 nAChR / 農薬 / 発達神経毒性 / 継世代影響 / 海馬歯状回 / 行動解析 / 不安様行動 / APO(有限発現経路) / ネオニコチノイド / 食殺・育子放棄 / 神経前駆細胞 / グリア |
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| Outline of Research at the Start |
環境化学物質の悪影響が世代を越えて伝わる継世代影響が懸念されている．一方，「胎児期や乳児期における環境因子が生後の各種疾患のリスクを高める」こともわかってきた．中でも，発達神経毒性は極めて重要な問題である．しかし，多くの農薬は神経毒性作用を有し，胎盤関門を容易に通過する事実はあるが，継世代影響の実態やそのメカニズムはほとんどわかっていない．本研究では，中枢神経の活動や代謝系を，生体マウスの覚醒下で脳の様々な細胞を可視化イメージング技術により，これまで困難であった投与期間全体を通じた連続観察や，最も感受性が高い胎子脳に対する薬剤影響を直接的に観察をすることで継世代影響を捉え，その原因を探る．
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| Outline of Annual Research Achievements |
クロチアニジン（CLO）が覚醒下マウスの脳神経系に及ぼす影響について，二光子顕微鏡を用いた神経細胞のCa2+イメージング解析を行い検証し，さらに，マイクロアレイ解析を用いて神経関連遺伝子の変動を解析した．また，免疫組織化学およびqRT-PCR解析を用いてミクログリアへの影響を検証した．
第一次体性感覚野（S1）にアデノ随伴ウイルスベクターを導入し，カルシウム感受性蛍光色素により神経活動を可視化した9週齢のC57BL/6J雄マウスを作製した．農薬評価書の無毒性量を参考に，CLOを2週間給水ゲルで自由摂取させ，二光子顕微鏡を用いて1週間ごと（計3回）に，S1の第2/3層における神経活動を観察・記録した．
CLO反復曝露により，「神経細胞の発火頻度」が有意に減少，「Ca2+波形下の面積」が有意に増加，「Ca2+応答の振幅」が増加傾向を示し，神経細胞への持続的なCa2+流入が認められた．また，CHRNA7やCHATなどコリン作動性シグナル伝達に関わる遺伝子が減少し，『進行性神経障害・シナプス伝達の攪乱』のネットワークとの関連が示された．これらの結果はCLO反復曝露によるα7 nAChRの発現低下および介在ニューロンの脱感作が，錐体細胞を過活動化させることを示唆する．また，海馬，外側手綱核および線条体においてミクログリア数が増加したものの，形態に変化はなく，Aif1，CD68，TNF-α，IL-10発現に有意差はなかった．海馬ではBDNF，IGF-1発現が有意に減少，nNOS，eNOS発現が減少傾向を示し，S1ではeNOS，線条体ではnNOS発現が減少傾向を示した．以上のことから，CLO反復曝露によって惹起される不安様行動や記憶・学習の低下の要因にミクログリアはほとんど寄与せず，主に海馬における神経保護因子の発現抑制が原因の一つであることが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では，申請書通り，2023年3月で実験終了予定であったが，新型コロナ感染症の影響で，実験が後ろ倒しになっており，1年，延長した．とくに，継世代影響には動物数の確保に大きな支障が出たため，その補足実験を現在実施中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
先行研究では，胎子・授乳期でのネオニコチノイド系農薬（ネオニコチノイド）曝露によって母性行動の変化がみられ，継世代的に食殺や育子放棄が増加した．この原因の一端としてオキシトシンおよびプロラクチンの分泌減少が示唆された．現在，ネオニコチノイドが母性行動に及ぼす継世代的に影響（エピゲノム毒性）を明らかにすべく，分娩前の巣作り行動や分娩後の産子のリトリービング試験から，母性行動を評価しており．F0世代母獣のCLO投与群では，1匹目の産子をリトリービングするまでにかかる秒数である「リトリービング潜伏秒数」が有意に長くなり，血中オキシトシン量が減少傾向を示したことから，CLOは分娩後の母性行動に影響を及ぼすことが示唆されている．また，F1世代母獣のCLO投与群では，巣作り行動試験スコアが低値だったことから，胎子期でのCLO曝露は母親になったときの妊娠中における母性行動に影響を及ぼすことが示唆された．今後は，さらに，その変化が継世代的に引き継がれるメカニズム（母性伝承［DNAメチル化とヒストンH3K27のトリメチル化など］）についても可能な限り検証する．
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