高齢者白血病に対するBCL2阻害剤、メチル化阻害剤治療の治療予測マーカーの探索

• Project/Area Number: 21K20913
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0902:General internal medicine and related fields
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 山谷 琴子 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (90909805)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 急性骨髄性白血病 / ベネトクラクス / デシタビン / 治療抵抗性 / RNA-seq / メチル化 / BCL2阻害剤 / DNAメチル化阻害剤 / 治療予測マーカー / methylation assay / 白血病 / DNAメチル基転移酵素阻害剤 / 治療効果予測マーカー

Outline of Research at the Start

高齢白血病患者の予後は不良で、副作用の低減と治療効果の向上を両立する治療戦略が模索されている。近年、BCL2阻害剤ベネトクラクスとDNAメチル化阻害剤デシタビンの併用療法が有望な治療効果が示され、第Ⅱ臨床研究まで進行している。しかし、併用療法によっても25％程度の症例で治療抵抗性が生じる。そのため、治療反応性を予測し、適した患者に適した治療を選別することが課題であるが、治療効果を裏付ける分子的基盤は不明な点が多い。本研究では、同臨床研究で採取された治療前後の患者検体を用いて、奏効群と非奏効群での遺伝子発現パターンやエピジェネティクス変化を解析し、治療効果予測マーカーの探索を行う。

Outline of Annual Research Achievements

抗アポトーシス因子であるBCL2阻害剤ベネトクラクス（VEN）とDNAメチル基転移酵素阻害剤デシタビン（DEC）との併用療法は高齢者急性骨髄性白血病において有望な治療効果を示した。しかし、一部の患者では効果が限定的であり同治療に対する治療抵抗性を認めている。そのため、治療反応性を予測し、適した患者に適した治療を選別することが課題であるが、患者選択や治療効果を裏付ける分子的基盤は不明な点が多い。本研究では、VEN/DEC治療前後の白血病細胞の遺伝子発現プロフェイリングを実施し、治療効果予測マーカーを特定することを目的とする。
治療奏効/非奏効グループのRNA発現パターンの比較解析(bulk RNA sequencing)より、非奏効グループにおいてエネルギー代謝関連遺伝子の亢進や免疫応答関連遺伝子群の抑制が有意にみられることを見いだした。そこで、該当年度は奏効/非奏効グループで有意な発現差を認めた遺伝子群に対し、in vitroでの検証を行った。白血病細胞である4種のcell line、MV4;11、HL60、OCI-AML3、THP-1に対し、VEN/DEC単独もしくは併用で処理し、RT-qPCRにて各候補遺伝子のRNA発現変化およびbisulfite pyrosequencingにてDNAメチル化評価を行った。また、候補遺伝子に対し、レンチウイルスベクターによる遺伝子高発現細胞株を作製し、VEN/DECの感受性を検証した。その結果、脂肪酸代謝に関与するPPARγがDECにより脱メチル化され、発現が亢進することを確認した。また、PPARγの高発現細胞では、細胞増殖スピードは抑制されるもののVEN/DECに対する薬剤感受性は低下していた。これらの結果からPPARγの発現亢進が脂肪代謝を亢進させ、VEN/DECへの抵抗性に関与している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「ベネトクラクスとデシタビンの併用療法」臨床研究において採取された治療前後の患者サンプルを用いてRNA-seq解析とmethylation assayを実施した。非奏効グループにおいてエネルギー代謝関連遺伝子の亢進や免疫応答関連遺伝子群の抑制が認められ、特徴的な遺伝子発現プロファリングを明らかにすることができた。興味深いことに尿素サイクルの律速酵素であるASS1の遺伝子発現が治療非奏功グループ群の治療前サンプルで有意に上昇していた。また、methylation assayの結果、非奏功グループ群で、脂肪酸代謝に関与するPPARγのプロモーターが有意にVEN/DEC治療により脱メチル化されることが明らかとなった。In vitroの検証においても、PPARγがDECにより脱メチル化され、発現が亢進することを確認した。また、PPARγの高発現細胞では、細胞増殖スピードは抑制されるもののVEN/DECに対する薬剤感受性は低下していた。これらの結果からPPARγの発現亢進が脂肪代謝を亢進させ、VEN/DECへの抵抗性に関与している可能性が示唆された。これらの遺伝子の機能解析をさらに進め、論文投稿予定である。

Strategy for Future Research Activity

前年度に引き続き候補遺伝子を過剰発現させ、VEN/DECに対する薬剤感受性を確認する予定である。また、これまでの研究成果によりPPARγの発現亢進がVEN/DECに対する抵抗性に関与している可能性が示唆された。そのため、PPARγの高発現が白血病細胞のエネルギー代謝に変調を与え、治療抵抗性に関与していると仮設を立て、エネルギー代謝（酸化的リン酸化、脂肪酸β酸化、解糖系）の変化をExtracellular Flux Analyserを用いて解析し、該当遺伝子の機能解析を行う。また、single cell RNA sequencingの解析も同時に進行しており、bulk RNA sequencingで見出された「非奏効グループでの免疫応答関連遺伝子群の発現抑制」がどのように治療抵抗性に関与しているのかを明らかにするために白血病細胞および免疫細胞 （T細胞、NK細胞）での活性化遺伝子発現を検出・検証する。

Research Products

• [Journal Article] Inhibition of BCL2A1 by STAT5 inactivation overcomes resistance to targeted therapies of FLT3-ITD/D835 mutant AML (2022)
  • Author(s): Yamatani K, Ai T, Saito K, Suzuki K, Hori A, Kinjo S, Ikeo K, Ruvolo V, Zhang W, Mak PY, Kaczkowski B, Harada H, Katayama K, Sugimoto Y, Myslinski J, Hato T, Miida T, Konopleva M, Hayashizaki Y, Carter BZ, Tabe Y, Andreeff M
  • Journal Title: Translational Oncology Volume: 18 Pages: 101354-101354
  • DOI: 10.1016/j.tranon.2022.101354
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Diverse mechanisms of resistance to Decitabine and Venetoclax therapy in newly diagnosed and relapsed/refractory AML inferred by transcriptome analysis (2022)
  • Author(s): Kotoko Yamatani, Tatsuro Watanabe, Kaori Saitoh, KaZuhiro Nitta, Kanako Kinjo, Kazuho Ikeo, Takashi Miida, Shinya Kimura, Su Xiaoping, Marina Konopleva,Yoko Tabe
  • Organizer: The 17th Congress of Asian Society of Clinical Pathology and Laboratory Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Biomarkers of clinical resistance to Decitabine and Venetoclax therapy inferred by transcriptome and methylation analyses (2022)
  • Author(s): Kotoko Yamatani, Abhishek Maiti, Tatsuro Watanabe, Kaori Saitoh, Kala Hayes, Sonoko Kinjo, Kazuho Ikeo, Takashi Miida, Shinya Kimura, Courtney D. DiNardo, Su Xiaoping, Yoko Tabe, Marina Konopleva
  • Organizer: 64th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Diverse mechanisms of resistance to Decitabine and Venetoclax therapy in newly diagnosed vs relapsed/refractory AML inferred by transcriptome analysis (2021)
  • Author(s): 1)Kotoko Yamatani, Yoko Tabe, Abhishek Maiti, Tomohiko Ai, Kaori Saitoh, Kazuhiro Nitta, Kanako Kinjo, Kazuho Ikeo, Takashi Miida, Courtney D. DiNardo, Su Xiaoping, Marina Konopleva
  • Organizer: 63nd ASH Annual Meeting and Exposition
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] BCL2A1: A Novel Target in Refractory/Relapsed AML with FLT3-ITD/D835 Double Mutations (2021)
  • Author(s): 2)Kotoko Yamatani, Bing Z. Carter, Marina Konopleva, Yoko Tabe, Michael Andreeff
  • Organizer: SOHO 2021 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research