Optimization of multiple method baced on neutron reflectometry for analysis of biogenesis of Gram-negative bacterial membrane.
| Project/Area Number |
21KK0126
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
塩田 拓也 宮崎大学, キャリアマネジメント推進機構, 准教授 (20819304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田岡 東 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (20401888)
宮崎 亮次 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30827564)
竹田 弘法 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (80816588)
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| Project Period (FY) |
2021-10-07 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥18,980,000 (Direct Cost: ¥14,600,000、Indirect Cost: ¥4,380,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
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| Keywords | 中性子反射率法 / BAM複合体 / グラム陰性菌 / 外膜 / ベータバレル / マグネットソーム |
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| Outline of Research at the Start |
近年、in vivo、in vitroでの解析、また構造生物学や生物物理学的手法の進歩により時間分解能もしくは、空間分解能のどちらかが非常に高い解析が可能となってきたたが、両者を同時に行える手法はまだ未開発である。その候補として、本国際共同研究では、複数の状態変化を内部構造も含めて詳細に解析できる「中性子反射率法」を、この手法の生体高分子への適応の第一人者であるオーストラリア、Monash大学Shen博士とともに実施する。技術適応を目指すモデルタンパク質として、グラム陰性菌の外膜タンパク質輸送装置、BAM複合体と、磁性細菌のマグネトソーム形成タンパク質MamQ、MamI、MamLに着目する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生体高分子の高い時空間分解能での解析を実現する手法として、中性子反射率法を中心に、in vivoでの架橋法、クライオ電子顕微鏡による構造解 析、高速AFM、そして単離膜を用いたin vitro再構築実験の5つの多角的な手法を駆使し、これらを組み合わせた統合的な解析法の確立を目指している。そのモデルケースとして、大腸菌のBAM複合体を中心とした外膜タンパク質輸送複合体および、磁性細菌のマグネトソーム形成タンパク質を用いる。本年度（2年目）は、豪州の渡航制限が解除されたため、研究代表者が国際共同研究者であるMoansh大学Shen博士を訪ね、中性子反射率法の計測結果を解析し、BAM複合体のサブユニットBamCが基質結合に呼応してダイナミックに構造変化することを見出した。また、BAM複合体のサブユニットが担当する基質のカテゴライズに成功した。BAM複合体の基質認識の初期段階を抽出し、その部分の構造解析のためのタンパク質調整に成功した。新生外膜タンパク質が内膜のSecトランスロコンからBAM複合体へと輸送される過程について、PpiD/YfgMというタンパク質が関与することを明らかにした。磁性細菌のマグネトソーム膜小胞形成に関する研究として、マグネトソーム鎖の長さを調節する蛋白質McaA/Bを発見した。一方、高速AFMによる膜小胞観察を目的とした研究では、AFM位相像により細菌表層に結合した膜小胞の物性が変化することを発見し、膜小胞の融合過程のモデルを提案した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
中性子反射率法では、共同研究が進展し、これまでのX線結晶構造解析や、クライオ電子顕微鏡解析では捉えることができなかったBAM複合体の構造変化を明らかにすることができた。また、BAM複合体のサブユニットごとの役割を解明することができ、今後の統合的な解析の基盤が形成できた。これらの成果を踏まえた、新規構造解析に向けたサンプル調整も順調に進んでいる。また、BAM複合体へ基質を送る分子システムについては、架橋法に加えコンピューターによる構造予測を駆使し、興味深い成果を得ることができている。また、磁性細菌の研究に関しては、新規因子が相次いで発見されており大きな進展があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
中性子反射率法で明らかにできた、サブユニットのダイナミックな構造変化を捉える方法を検討し、結晶構造解析およびin vivo部位特異的光架橋法でより詳細に解析することを目指す。また、in silico解析と部位特異的光架橋法で新規に同定した因子であるPpiD/YfgMについて、中性子反射率法での解析のためのサンプル調整や、単離膜画分での解析を実施する。
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Report
(2 results)
Research Products
(41 results)
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[Presentation] Discovery of conserved rule and role behind the assembly of bacterial beta-barrel membrane proteins2023
Author(s)
Takuya Shiota, Edward Germany, Nakajohn Thewasano, Kenichiro Imai, Yuki Maruno, Rebecca Bamert, Rhys Dunstan, Yue Ding, Yukari Nakajima, XiangFen Lai, Chaille Webb, Christopher Stubenrauch, Kher Shing Tan, Hsin-Hui Shen, Trevor Lithgow
Organizer
The 48th Lorne Conference on Protein Structure and Function
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Int'l Joint Research
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