再生医療のための幹細胞凍害防止保存液

• Project/Area Number: 22300178
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Medical systems
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 玄 丞烋 京都大学, 再生医科学研究所, 准教授 (90283655)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松村 和明 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 准教授 (00432328)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000); Fiscal Year 2012: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2011: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2010: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000)
• Keywords: 幹細胞 / ヒトiPS細胞 / ヒトES細胞 / ガラス化法 / カルボキシル化PLL / 凍結保存液 / 不凍ポリアミノ酸 / DAP213 / 凍害防止保存液 / ε-ポリ-L-リジン(PLL) / カルボキシル化ポリリジン / 氷の再結晶化抑制効果 / iPS細胞 / ガラス化凍結保存

Research Abstract

(目的)ヒト幹細胞の臨床応用で安定な細胞の保存は重要課題の1つである。保存剤として良く使われるDAP213はDMSOの細胞毒性が無視できないため、代替物を用いた凍結保存液が望ましい。我々はすでにDMSOを含まない新規不凍ポリアミノ酸含有保存剤でヒトiPS細胞をガラス化法で凍結保存することを報告した。今年度はこの保存液がhES細胞で同様の保存効果が得られるかを検討した。
(方法)hES細胞をコロニー状態でカルボキシル化PLLとEthylene glycolとSucroseを含む新規凍結保存剤で液体窒素中で急速凍結した。保存後、再び解凍しSNLフィーダー細胞上で培養後、細胞の形態学的観察を行い、また未分化能力の指標となるアルカリホスファターゼ染色、幹細胞マーカーに対する免疫染色を検討した。また核型解析を行い染色体に異常がないかを確認した。
(結果)不凍ポリアミノ酸を含む凍結保存剤で凍結したhES細胞は、DAP213(DMSO:Acetamide:Propylene Glycol=2:1:3)に比べると、コロニー状態ではDMSOを用いた保存剤の細胞より不凍ポリアミノ酸含有保存剤の方がコロニーの成長が早く、細胞数も2倍近くあった。マトリゲルコートディッシュに播種したhES細胞でも不凍ポリアミノ酸含有保存剤は翌日から細胞の生着が見られたが、DAP213ではわずかしか生着しなかった。不凍ポリアミノ酸凍結保存剤で保存したhES細胞はアルカリフォスファターゼ染色も正常で、免疫染色では未分化マーカーは正常に発現していた。核型解析でも異常は認められなかった。これよりhES細胞において新規不凍ポリアミノ酸含有凍結保存剤はDAP213に代わり得るものと確信できた。さらにhES細胞の臨床応用を考えると、将来的には細胞の凍結は緩慢凍結法が望ましく検討を重ねていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Development of a low toxicity and completely serum-free vitri fication system combining a cryo-nano-hole vitrification container with antifreeze polyamino-acid (carboxylated poly-l-lysine) for art (2012)
  • Author(s): Inui, H., Mizuno, J., Hyon, S-H., Matsumura, K.
  • Journal Title: Journal of REPRODUCTION ENGINEERING Volume: (in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effective vitrification of human induced pluripotent stem cells using carboxylated ε-poly-L-lysine (2011)
  • Author(s): Matsumura, K., Bae, J-Y., Kim, H-H., Hyon, S-H.
  • Journal Title: Cryobiology Volume: 63 Issue: 2 Pages: 76-83
  • DOI: 10.1016/j.cryobiol.2011.05.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ARTのためのクライオナノホールコンテナと不凍ポリアミノ酸(カルボキシル化Poly-L-Lysine)を用いた低毒性,完全無血清のガラス化保存システムの開発 (2011)
  • Author(s): 水野仁二, 玄丞烋, 松村和明, 乾裕昭, 菊地瑛子, 野口香里, 丹知百合, 赤石一幸, 阿部崇, 安齋憲, 村山嘉延
  • Journal Title: 日本受精着床学会雑誌 Volume: 28 Pages: 23-30
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 安全な凍結保存を目指した当院の取り組み (2011)
  • Author(s): 赤石一幸, 水野仁二, 丹知百合, 菊地瑛子, 野口香里, 安齋憲, 玄丞烋, 松村和明, 乾裕昭
  • Journal Title: 日本臨床エンブリオロジスト学会雑誌 Volume: 13 Pages: 50-56
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 不凍ポリアミノ酸の再生医療と食品工業への展開 (2011)
  • Author(s): 松村和明, 玄丞烋
  • Journal Title: バイオインダストリー Pages: 35-42
• [Journal Article] 不凍ポリアミノ酸を用いたヒトiPS細胞の凍結保存 (2011)
  • Author(s): 玄丞烋, 松村和明
  • Journal Title: 医学のあゆみ Volume: 238 Pages: 1212-1214
• [Journal Article] Polyampholytes as cryoprotective agents for mammalian cell cryopreservation. (2010)
  • Author(s): Kazuaki Matsumura
  • Journal Title: Cell Transplant. Volume: 19 Pages: 691-699
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Large scale vitrification for the preservation of human induced pluripotent stem (iPS) cells using carboxylated poly-L-lysine. (2010)
  • Author(s): Kazuaki Matsumura
  • Journal Title: Low Temperature Medicine Volume: 36 Pages: 65-68
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PS/ES細胞の大規模保存システムの開発 (2010)
  • Author(s): 松村和明
  • Journal Title: 再生医療 Volume: 19 Pages: 349-354
• [Presentation] Establishment of effective cryopreservation method of a human iPS cell and an embryonic stem cell (2011)
  • Author(s): Suong-Hyu Hyon
  • Organizer: The 3^<rd> Asian Biomaterials Congress
  • Place of Presentation: BEXCO Busan(釜山・韓国)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] Novel cryoprotective agent (CPA) of stem cell for regenerative medicine (2011)
  • Author(s): Hyon, S-H., Matsumura, K
  • Organizer: World Biobanking Summit
  • Place of Presentation: Congress Center Hamburg(ハンブルグ・ドイツ)
• [Presentation] 凍結保護活性を持つカルボキシル化ポリリジン溶液の固体NMR測定による凍結時の挙動の評価 (2011)
  • Author(s): 松村和明, 林文晶, 長島敏雄, 玄丞烋
  • Organizer: 第56回低温生物工学会大会
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター(盛岡)
• [Presentation] Creation of antifreeze polyaminoacid with cryoprotective function (2011)
  • Author(s): Hyon, S-H., Matsumura, K
  • Organizer: Ice-Binding Protein Conference
  • Place of Presentation: Queen's University(オンタリオ・カナダ)
• [Presentation] 凍結保護能を持つ両性電解質高分子の凍結時挙動の固体NMRによる解析 (2011)
  • Author(s): 松村和明・林文晶、長島敏雄
  • Organizer: 第60回高分子討論会
  • Place of Presentation: 岡山大学(岡山)
• [Presentation] Effective Cryopreservation of the stem cell for a regeneration medicine (2011)
  • Author(s): Matsumura, K., Hyon, S-H
  • Organizer: 4th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell
  • Place of Presentation: Beijing International Convention Center(北京・中国)
• [Presentation] 細胞凍結保護ポリマーの凍結挙動 (2011)
  • Author(s): 松村和明, 林文晶, 長島敏雄, 玄丞烋
  • Organizer: 第33回日本バイオマテリアル学会
  • Place of Presentation: 京都テルサ(京都)
• [Presentation] クライオナノホールコンテナと不凍ポリアミノ酸を用いた低毒性・完全無血清ガラス化保存システムの開発:DMSOとSucrose free、代替に不凍ポリアミノ酸を用いた検討 (2010)
  • Author(s): 水野仁二
  • Organizer: 第55回日本生殖医学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: あわぎんホール(徳島県)
  • Year and Date: 2010-11-11
• [Presentation] Development of DMSO/Serum-free cryopreservation system for stem cell, iPS Cell, and fertilizes ovum using antifreeze polya mino acid. (2010)
  • Author(s): Suong-Hyu Hyon
  • Organizer: The 10th International Symposium on Developmental Biotechnology
  • Place of Presentation: 慶北大学(Daegu, Korea)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-10-29
• [Presentation] Novel vitrification of human induced pluripotent stem cells. (2010)
  • Author(s): Suong-Hyu Hyon
  • Organizer: TERMIS AP 2010 Meeting
  • Place of Presentation: Sheraton on the Park(Sydney, Australia)
  • Year and Date: 2010-09-16
• [Presentation] クライオナノホールコンテナを用いたDMSOとSucrose freeの低毒性ガラス化保存システムの開発 : 不凍ポリアミノ酸を用いたマウス胚盤胞での有効性と安全性の検証 (2010)
  • Author(s): 水野仁二
  • Organizer: 第28回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2010-07-28
• [Presentation] Successful cryopreservation of human mesenchymal stem cells and vitrification of human induced pluripotent stem cells using carboxylated poly-L-lysine (2010)
  • Author(s): Kazuaki Matsumura
  • Organizer: 47th Annual Meeting of the Society for Cryobiology
  • Place of Presentation: Bristol Marriott Royal Hotel(Bristol, United Kingdom)
  • Year and Date: 2010-07-18
• [Presentation] Novel low toxic cryoprotective agents as asternatives to DMSO (2010)
  • Author(s): Kazuaki Matsumura
  • Organizer: The 1st International Congress on Controversies in Cryopreservation of Stem Cells, Reproductive Cells, Tissue and Organs.
  • Place of Presentation: Palacio de Conglesos (Valencia, Spain)
  • Year and Date: 2010-05-29
• [Remarks]
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/hl/news6/2010/101201_3.htm