無保護でのペプチド合成のための新規ペプチド合成酵素の探索と開発

• Project/Area Number: 22380053
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Applied microbiology
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 横関 健三 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10432345)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小川 順 京都大学, 農学研究科, 教授 (70281102) ; 萩下 大郎 京都大学, 農学研究科, 准教授 (20432346)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000); Fiscal Year 2012: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2011: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2010: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: ジペプチド / βペプチド / L-アミノ酸メチルエステル / オリゴペプチド / ペプチド

Research Abstract

ペプチドには有用な生理活性あるいは新たな物性を示すものが数多く知られており、ペプチドの機能性解明や生産法開発に関する研究が盛んに行われている。これまで申請者のグループではアミノ酸メチルエステル体をアシル供与体、アミノ酸を求核剤としてペプチド合成反応に使用できる新規酵素を発見し、短時間で効率のよい新しいペプチド生産法を確立している。この酵素は広い基質特異性を示す一方、唯一プロリンだけは求核剤として認識されにくいという課題があった。本研究ではプロリンを求核剤として効率良く利用できる新規酵素の探索を行った。
まず本研究室保存菌697株を対象に、アラニンメチルエステルとプロリンからアラニン-プロリンペプチドを生成する微生物の探索を実施した。この結果15株においてアラニン-プロリンペプチドの蓄積が確認された。最も生成活性の高かった微生物はStreptomyces sp.AKU2711株であり、この菌株の無細胞抽出液におけるアラニン-プロリンペプチド生成活性は10,8mU/mgという比較的高い活性を示した。
次いで自然界からアラニン-プロリンペプチド合成活性を保持する微生物の単離を行った。アセチルプロリンやアラニン-プロリンペプチドを単一炭素源として利用できる微生物を約300株土壌より分離できた。この微生物の内、6株において高いアラニン-プロリンペプチド生成活性を確認でき、中でも1株についてはAKU2711株の2倍の活性を保持していることを明らかにできた。
以上の様にプロリンを含むあらゆるペプチドの合成を可能とするシステムの構築の目処が立ったため、さらに新規機能性ペプチド開発の原料としての利用を念頭に置いた水酸化アミノ酸の生産法の開発を実施した。アミノ酸水酸化酵素であるジオキシゲナーゼ類の基質特異性解析と反応産物の構造解析を行ったところ、分岐鎖アミノ酸に対して広い水酸化活性を保持していることを明らかにできた。

Research Products

• [Journal Article] Characterization of Bacillus thuringiensis L-isoleucine dioxygenase toward the production of useful amino acids (2011)
  • Author(s): Hibi, M., T.Kawashima, T.Kodera, S.V.Smirnov, P.M.Sokolov, M.Sugiyama, S.Shimizu, K.Yokozeki, J.Ogawa
  • Journal Title: Appl.Environ.Microbiol. Volume: 77 Issue: 19 Pages: 6926-6930
  • DOI: 10.1128/aem.05035-11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] アミノ酸水酸化触媒としてのα-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ (2011)
  • Author(s): 日比慎、小川順
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー Volume: 69 Pages: 384-386
  • NAID: 10029466411
• [Journal Article] 代謝的視点からの機能探索に基づく産業プロセス用酵素開発 (2011)
  • Author(s): 小川順、櫻谷英治、岸野重信、日比慎、堀之内伸行、横関健三、清水昌
  • Journal Title: BIOINDUSTRY Volume: 28 Pages: 7-13
• [Journal Article] A novel 1-isoleucine metabolism in Bacillus thuringiensis generating (2S, 3 R, 4 S)-4-hydroxyisoleucine, a potential insulinotropic and anti-obesity amino acid (2010)
  • Author(s): Ogawa, J., T.Kodera, S.V.Smirnov, M.Hibi, N.N.Samsonova, R.Koyama, H.Yamanaka, J.Mano, T.Kawashima, K.Yokozeki, S.Shimizu
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: (in press) Pages: 1-10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Metabolic engineering of Escherichia coli to produce (2S, 3R, 4S)-4-hydroxyisoleucine (2010)
  • Author(s): Smirnov, S.V., T.Kodera, N.N.Samsonova, V.A.Kotlyarova, N.Y.Rushkevich, A.D.Kivero, P.M.Sokolov, M.Hibi, J.Ogawa, S.Shimizu.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: 88 Pages: 719-726
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アミノ基修飾酵素と水酸化酵素を共役させたβ-ヒドロキシアミノ酸生産系の開発 (2012)
  • Author(s): 日比慎、笠原拓也、河嶋隆志、横関健三、清水昌、小川順
  • Organizer: 日本農芸化学会2012年度大会
  • Place of Presentation: 京都(京都女子大学)
  • Year and Date: 2012-03-25
• [Presentation] Bacillus thuringiensis 2e2株由来Fe(II)/α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによる光学活性スルフォキシド生産 (2012)
  • Author(s): 日比慎、清水昌、横関健三、小川順
  • Organizer: 日本農芸化学会2012年度大会
  • Place of Presentation: 京都(京都女子大学)
  • Year and Date: 2012-03-25
• [Presentation] Novel dioxygenases for hydroxy amino acid production (2011)
  • Author(s): Hibi M., Shimizu S., Yokozeki K., Ogawa J.
  • Organizer: Biotrans 2011
  • Place of Presentation: Sicilia, Italia(招待講演)
  • Year and Date: 2011-10-04
• [Presentation] α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼを利用した有用アミノ酸の立体選択的生産 (2011)
  • Author(s): 日比慎、河嶋隆志、清水昌、横関健三、小川順
  • Organizer: 第63回日本生物工学会大会(2011)
  • Place of Presentation: 東京(東京大学)
  • Year and Date: 2011-09-26
• [Presentation] α-Ketoglutarate-dependent dioxygenase : Biocatalyst for useful amino acid production (2011)
  • Author(s): Hibi M., Shimizu S., Yokozeki K., Ogawa J.
  • Organizer: The 16th Japanese-German Workshop on Enzyme Technology
  • Place of Presentation: 富山(富山国際会議場)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-14
• [Presentation] Bacillus thuringiensis 2e2株由来L-isoleucine dioxygenaseによる有用アミノ酸の立体選択的合成 (2011)
  • Author(s): 日比慎、河嶋隆志、清水昌、横関健三、小川順
  • Organizer: 2011年度日本農芸化学会大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2011-03-26
• [Book] 生物学辞典(アデニンアラビノシド、アラニルグルタミン、L-システイン、ジデオキシイノシン、L-リジン、L-トリプトファン) (2010)
  • Author(s): 横関健三
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 東京化学同人
• [Book] 酵素利用技術大系(小宮山眞監修)第7編-第1章-第2節(5.新規酵素を用いるオリゴペプチド工業新製法の開発) (2010)
  • Author(s): 横関健三
  • Total Pages: 3
  • Publisher: エヌ・ティー・エス