染色体ベクターによるゲノム解析法の確立

• Project/Area Number: 22510218
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: System genome science
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 池野 正史 慶應義塾大学, 医学部, その他 (80298546)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2012: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2011: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2010: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: ヒト人工染色体 / HAC / HLA-G / クロマチン / 遺伝子発現制御 / プロモーター / ゲノム / 組換え / ヒト人工染色体ベクター

Research Abstract

本研究の目的は、1コピーで安定に維持されるHACベクターを利用して、ゲノム配列機能を検定する方法の開発と確立である。今年度はヒト主要組織適合抗原遺伝子クラスターの一つであるHLA-G遺伝子上流域に見いだされた、発現抑制に関与する候補配列の機能検証を行った。
1、HLA-Gの最小プロモーターおよびCMVプロモーターとEGFP遺伝子からなる発現カセットに、遺伝子抑制の候補配列を連結した検証用コンストラクトを作製した後に、HACベクターを保有するヒトHT1080細胞に導入し、HACベクターに1分子の検証用コンストラクトを搭載した細胞株を10株作製した。
2、各細胞株のEGFP蛍光観察とRT-PCRによる発現解析より、検証配列にはHLA-G遺伝子プロモーターに対する発現抑制効果があり、加えてCMVプロモーターに対する抑制効果があることを実証した。本配列による遺伝子抑制は、特定プロモーターに対する効果ではなく、一般的効果であることが推測された。
3、発現抑制効果の一般性を検証するためにマウス細胞を用いて検討し、HT1080細胞と同様な発現抑制効果を確認した。
4、発現抑制に関与する配列は、トランスポゾンであるLINE1の一部に対応した。遺伝子発現の抑制機能に関して、一般的なLINE1配列と検証配列とを比較検討した。その結果、HLA-Gの上流に見いだされた特定のLINE配列が発現抑制効果を有することがわかった。
5、抑制効果の機構を明らかにするために、特定LINE配列のDNA2次構造に注目して検討を進めた。

Research Products

• [Journal Article] Construction and use of a bottom-up HAC vector for transgene expression (2011)
  • Author(s): Masashi Ikeno
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 738 Pages: 101-110
• [Presentation] LINE family members are potential negative regulators of gene expression (2011)
  • Author(s): 池野正史
  • Organizer: 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川)
  • Year and Date: 2011-12-15
• [Presentation] 染色体ベクターによる遺伝子発現の制御領域の解析 (2010)
  • Author(s): 池野正史
  • Organizer: 日本分子生物学会年会(BMB2010)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(神戸)
  • Year and Date: 2010-12-09