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脊椎動物胚における光活性化型蛍光蛋白質を用いた分泌性蛋白質の動態解析

Research Project

Project/Area Number 22657054
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Developmental biology
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

平良 眞規  東京大学, 大学院・理学系研究科, 准教授 (60150083)

Project Period (FY) 2010
Project Status Completed (Fiscal Year 2010)
Budget Amount *help
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2010: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Keywords脊椎動物 / アフリカツメガエル / 胚発生 / モルフォゲン / Wnt / sFRP / 光活性化型蛍光蛋白質
Research Abstract

モルフォゲンとして働く分泌性蛋白質の一連の挙動を知ることは、発生過程での位置情報の形成やパターニングを考える上での基礎となる。しかしこれまでリガンドの拡散動態についての数理モデル使った解析は行われていなかった。一方、我々はこれまでWntリガンドと、それに結合する分泌性蛋白質sFRP(Frzb、Crescentなど)に蛍光蛋白質を融合させ、アフリカツメガエル胚に発現させてその分布の違いを観察した。そこで本研究では、WntとsFRPの拡散動態の数理モデルを構築し、拡散パラメーターの定量化を試み、さらに細胞間隙での拡散性を規定する要因を探った。
1)光転換型蛍光蛋白質mKikGRと数理モデルを用いた動態解析
mKikGR融合蛋白質をアフリカツメガエルの初期原腸胚に発現させ、細胞間隙に分泌されたものに対して光照射により緑から赤への光転換を行い、経時的に共焦点顕微鏡で赤色蛍光の減衰を測定した。次いでそのデータを、拡散方程式から観察方法に適するように1次元の単純拡散として導いた数式にフィッティングさせることで、見かけの拡散係数を求めることに初めて成功した。その結果、Wnt8は0.06μm2/s、Frzbは0.18μm2/s、Crescent存在下のWnt8は0.2μm2/sと計算された。これらの値はCrescentによりWnt8の拡散性が増大するというこれまでの定性的結果と一致するものである。
2)細胞外マトリックスとの相互作用
分泌性Venus(SP-Venus)が細胞間隙に検出されないことから、蛋白質が細胞間隙に留まるには細胞外基質との極作用が必要であるとの仮説の下に以下の2つの実験を行った。1つはヘパラン硫酸に注目し、SP-Venusにヘパリン結合配列(HB)を付加したところ細胞間隙に検出されるようになった。2つめは抗HA抗体のcDNAをクローニングし、膜貫通ドメイとを融合してカエル胚で発現させたところ、HAタグを付加したSP-Venusが抗体発現領域の細胞間隙に検出された。これらよりリカンドが細胞外間隙に局在して分布するには細胞外基質との相互作用が必須の条件となることが示唆された。

Report

(1 results)
  • 2010 Annual Research Report
  • Research Products

    (5 results)

All 2010 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Comparison of Liml expression in embryos of frogs with different modes of reproduction.2010

    • Author(s)
      Venegas-Ferrin, M., Sudou, N., Taira, M., del Pino, E.M.
    • Journal Title

      Int. J. Dev. Biol.

      Volume: 54 Pages: 195-202

    • Related Report
      2010 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 光変換型蛍光蛋白質によるWntの動的拡散の定量的解析2010

    • Author(s)
      三井優輔
    • Organizer
      日本発生生物学会夏季シンポジウム2010
    • Place of Presentation
      八王子セミナーハウス
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Presentation] Enhanced diffusion and signaling range expansion of Wnt ligands by secreted Frizzled-related proteins.2010

    • Author(s)
      Yusuke Mii, Atsushi Mochizuki, Masanori Taira
    • Organizer
      日本発生生物学会第43回大会
    • Place of Presentation
      京都国際会議場
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Book] 生物学辞典(項目「アフリカツメガエル」、「生体染色」、「顕微注射」を執筆)2010

    • Author(s)
      平良眞規
    • Total Pages
      3
    • Publisher
      東京化学同人
    • Related Report
      2010 Annual Research Report
  • [Remarks]

    • URL

      http://133.11.2.20/users/lmb/index.php

    • Related Report
      2010 Annual Research Report

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Published: 2010-08-23   Modified: 2016-04-21  

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