プラズマ技術を用いた角化細胞・培養皮膚への遺伝子導入法の開発

• Project/Area Number: 22659206
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Dermatology
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 橋本 公二 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00110784)
• Project Period (FY): 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2010: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
• Keywords: 遺伝子導入 / 角化細胞 / プラスマ / 培養皮膚 / 遺伝子治療 / 細胞障害 / 高電界 / イオン

Research Abstract

プラズマトランスジェニックスは高電界下でのイオンや反応活性種の働きを利用した全く新たなコンセプトによる分子導入法であり、遺伝子やその他の分子を効率よく簡便かつ迅速に導入することが可能である。本研究ではプラズマによる角化細胞への遺伝子導入の効率、持続性、細胞障害性に関して明らかにし、プラズマによる遺伝子導入角化細胞を用いた培養皮膚の作製の可能性、培養皮膚への直接の遺伝子導入の可能性について明らかにする。正常ヒト皮膚角化細胞を無血清培養法にて培養し、6cmのディッシュに角化細胞を播種し、50%程度のコンフルエンシーとなった時点で遺伝子導入を行った。プラズマ発生装置の可変パラメーラーとしては、電圧、duty,time,rotation speed,gas,gapがあるが、電圧、frequency,gasとgapは一定として、その他を変更し導入効率を観察した。遺伝子はGFPを用いた。プラズマ発生装置にディッシュを装着し、プラズマを照射する装置を用いた。電圧は2万5千ボルトに固定し、周波数は65で固定した。(1)コントロール群(照射なし)(2)duty;40,2秒1回、(3)duty;40,2秒2回、(4)duty;60,2秒1回の4群で比較した。(1)群では細胞に障害性はなく、3日後にはコンフルエントに達した。(2)群では照射直後には一部の細胞で浮遊したものがみられたが90%以上の細胞はダメージを認めず、3日後にはコンフルエントに達したがGFPの発現は全くみられなかった。(3)群では照射直後には照射部に一致して細胞壊死がみられ付着している細胞は10%以下となったが3日目には回復し増殖がみられた。遺伝子の発現はほとんどみられなかった。(4)群では照射部のダメージが強く、ほとんどの細胞が壊死となった。3日目でも細胞は回復せず不可逆的な細胞ダメージであった。遺伝子発現は全くみられなかった。COS7細胞でも同様の条件で遺伝子導入を試みたが10%以下の導入率であり、従来の報告とは異なっていた。プラズマ技術を用いて角化細胞への遺伝子導入を試みたが細胞障害性が高く、導入効率が低いため培養皮膚を用いたex vivo遺伝子治療開発には適さないことが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Auto- and cross-induction by betacellulin in epidermal keratinocytes. (2010)
  • Author(s): Shirakata Y, Tokumaru S, Sayama K, Hashimoto K
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 58 Pages: 162-4
  • NAID: 10027400978
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inflammatory mediator TAK1 regulates hair follicle morphogenesis and anagen induction shown by using keratinocyte-specific TAK1-deficient mice. (2010)
  • Author(s): Sayama K, Kajiya K, Sugawara K, Sato S, Hirakawa S, Shirakata Y, Hanakawa Y, Dai X, Ishimatsu-Tsuji Y, Metzger D, Chambon P, Akira S, Paus R, Kishimoto J, Hashimoto K
  • Journal Title: PLoS One Volume: 5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] E2 Polyubiquitin-conjugating enzyme Ubc13 in keratinocytes is essential for epidermal integrity. (2010)
  • Author(s): Sayama K, Yamamoto M, Shirakata Y, Hanakawa Y, Hirakawa S, Dai X, Tohyama M, Tokumaru S, Shin MS, Sakurai H, Akira S, Hashimoto K
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 285 Pages: 30042-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PPARγ mediates innate immunity by regulating the 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 induced hBD-3 and cathelicidin in human keratinocytes. (2010)
  • Author(s): Dai X, Sayama K, Tohyama M, Shirakata Y, Hanakawa Y, Tokumaru S, Yang L, Hirakawa S, Hashimoto K
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 60 Pages: 179-86
  • NAID: 10027841095
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Occupational trichloroethylene hypersensitivity syndrome with human herpesvirus-6 and cytomegalovirus reactivation (2010)
  • Author(s): Watanabe H, Tohyama M, Komijima M, Nakajima T, Yohida T, Hashimoto K, Iijima M
  • Journal Title: Dermatology Volume: 221 Pages: 17-22
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluctuation of blood and skin plasmacytoid dendritic cells in drug-induced hypersensitivity syndrome. (2010)
  • Author(s): Sugita K, Tohyama M, Watanabe H, Otsuka A, Nakajima S, Iijima M, Hashimoto K, Tokura Y, Miyachi Y, Kabashima K.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol Volume: 126 Pages: 408-410
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Overlap between the Drug-induced hypersensitivity syndrome and the Stevens Johnson Syndrome (2010)
  • Author(s): Hashimoto K
  • Organizer: 4^<th> International Drug Hypersensitivity Meeting
  • Place of Presentation: Rome, Italy
  • Year and Date: 2010-06-10
• [Presentation] Successful treatment of severe pemphigus vulgaris with high-dose intravenous immunoglobulin. (2010)
  • Author(s): Shirakata Y, Ishikawa M, Murakami S, Hashimoto K
  • Organizer: 9^<th> Meeting of the German-Japanese Society of Dermatology
  • Place of Presentation: Weimar, Germany
• [Presentation] Deletion of SOCS3 in the epidermis causes impaired skin wound healing in vivo. (2010)
  • Author(s): Shirakata Y, Yang L, Tsuda T, Tohyama M, Miyawaki S, Kameda K, Sayama K, Yoshimura A, Hashimoto K
  • Organizer: The 40^h Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • Place of Presentation: Helsinki, Finland
• [Presentation] Interferon alpha enhances IL-22 receptor expression on epidermal keratinocytes (2010)
  • Author(s): Tohyama M, Yang L, Tsuda T, Miyawaki S, Shirakata Y, Sayama K, Hashimoto K
  • Organizer: The 40^h Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • Place of Presentation: Helsinki, Finland
• [Presentation] Mite allergen is a danger signal for the skin (2010)
  • Author(s): Sayama K, Dai X, Shirakata Y, Tohyama M, Miyawaki S, Hirakawa S, Hashimoto K
  • Organizer: The 40^h Annual Meeting of the European Society for Dermatological Research
  • Place of Presentation: Helsinki, Finland