Structural and functional analysis of diverse RNA helicases involved in innate immunity

• Project/Area Number: 22H00403
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥42,900,000 (Direct Cost: ¥33,000,000、Indirect Cost: ¥9,900,000); Fiscal Year 2024: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000); Fiscal Year 2023: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000); Fiscal Year 2022: ¥18,200,000 (Direct Cost: ¥14,000,000、Indirect Cost: ¥4,200,000)
• Keywords: RNA / RNAヘリカーゼ / 免疫 / クライオ電子顕微鏡 / helicase / innate immunity

Outline of Research at the Start

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。

Outline of Annual Research Achievements

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。本年度は、前年度に調製したMDA5タンパク質、RNAを用いて、in vitroにおいてMDA5:RNAフィラメント複合体を再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析をおこなった。先行研究を参考に、ヒト由来MDA5と長鎖dsRNAを混合することにより再構成したMDA5:RNAフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いて電子顕微鏡画像データを取得した。プログラムCryoSPARCによる画像解析の結果、ヒトMDA5:RNAフィラメント複合体の密度マップを得ることに成功し、プログラムCOOTとプログラムPhenixを用いてモデル構築と構造精密化を行い、MDA5:RNAフィラメント複合体の立体構造を決定した。さらに、様々なATPアナログ（AMPPNPやADPなど）の存在下でMDA5:RNAフィラメント複合体を再構成し、複数の複合体構造を決定した。これらの複合体構造の比較から、ヒトMDA5によるATP加水分解サイクルにおけるRNA認識のメカニズムを明らかにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

MDA5:RNAフィラメント複合体の構造決定には成功したが、LGP2:MDA5:RNAヘテロフィラメント複合体の構造決定には成功していないため。

Strategy for Future Research Activity

複合体再構成条件、クライオ電子顕微鏡測定条件などを検討し、LGP2:MDA5:RNAヘテロフィラメント複合体の構造決定を目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] MIT/Arc Institute(米国)
• [Presentation] Structural mechanism of IS110 bridge recombinases (2024)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Keystone Symposia
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structure and engineering of CRISPR nuclease-protease (2023)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Frontiers in Genome Engineering
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structure, function and engineering of the type III-E CRISPR nuclease-protease complex (2023)
  • Author(s): Hiroshi Nishimasu
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference
  • Int'l Joint Research / Invited