Development of 100-fps high-speed AFM and demonstration of its capabilities

• Project/Area Number: 22H00405
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 安藤 敏夫 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任教授 (50184320)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2025)
• Budget Amount: ¥40,170,000 (Direct Cost: ¥30,900,000、Indirect Cost: ¥9,270,000); Fiscal Year 2025: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000); Fiscal Year 2024: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000); Fiscal Year 2023: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000); Fiscal Year 2022: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
• Keywords: 高速AFM / タンパク質 / ダイナミクス / 分子プロセス / バイオイメージング / 低侵襲イメージング / 高速イメージング / 機能動態

Outline of Research at the Start

代表者が開発した世界最速の高速AFMは、個々のタンパク質分子の動的な構造とプロセスを直接可視化できる唯一の技術である。高速AFMは世界に普及し、そのバイオ応用研究の成果報告が近年急速に増大している。しかし，機能・構造を乱さずにイメージングできる最高速度は10フレーム/秒(fps)前後であり、この速度では観察できない動的現象と試料系が多く存在する。そこで、装置デバイスの速度性能向上に加え、低侵襲性を向上させる技術を開発することにより、速度性能を更に上げ、標準的なタンパク質分子で100 fpsを実現する。その威力を従来の高速AFMでは困難であった速い動的現象と脆弱なバイオ試料系の観察により実証する。

Outline of Annual Research Achievements

代表者が開発した高速AFMは機能動作中のタンパク質分子を直接動画撮影できる唯一の顕微鏡である。すでに世界中で利用され、応用研究が急速に進展している。しかし、イメージング可能な最高速度は毎秒10画像（10fps）程度であり、この速度では捉えられない試料系、動的現象が多く存在する。装置を構成する諸デバイスを更に高速化することは、フィードバック帯域を向上させ、それによりイメージング速度を向上させるための正攻法だが、限界がある。そこで、フィードバック帯域の向上だけに頼らず、試料への低侵襲性能を更に上げることなどにより、高速AFMの最大可能なイメージング速度を従来の10倍程度（100fps）にまで上げることを目指し、本研究において以下4点の技術開発に取り組んできた。 (1)X方向の往復走査の内、往き走査時にのみ探針を試料に間欠接触させて画像取得するOTI法とゲインを自動調節可能なダイナミックPID制御法とを組み合わせることによる低侵襲性能の更なる向上、(2)カンチレバーのレーザー励振に基づく安定な質量（M値）制御法によるカンチレバーの共振周波数の向上、(3)スキャナーの高速X走査に伴って生ずるZ方向の共振振動の除去（Z方向共振の伝達関数を利用する新しい制御法による）、(4)カンチレバーメーカーとの共同研究による更に共振周波数が高く、ばね定数の小さい微小カンチレバーの作製。(1)-(3)については、期待した成果を得ることができた。(4)についてはある程度進展したが、未だ条件検討を要する。これらの開発により、試料の形状、基板上での配置、脆弱性などの条件に依存するが、X方向に配向した微小管では100fps、アクチン線維では70fpsを達成した。段差が急で、且つ、脆弱な回転軸のないF1-ATPaseを30fpsで撮影し、これまで捉えられなかった中間体を捉えることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画した技術開発は順調に進展し、目標とした速度性能をほぼ達成した。

Strategy for Future Research Activity

技術開発については、M値制御に用いる２階微分回路の広帯域化とカンチレバーの更なる微小化による共振周波数の一層の向上、更に微小化したカンチレバーに適した光てこ光学系の改良が残されている。これらについて開発を継続する。一方、最高100fpsの撮影速度を有する高速AFMの威力を示す応用研究を本格化する。具体的には、(i)すでに着手した回転軸のないF1-ATPase(α3β3複合体）のATPase反応に伴う構造変化、(ii)骨格筋ミオシンとアクチン線維との相互作用に伴う構造変化のイメージングに取り組む。後者については、最適なアッセイ系を構築する。これら他、随時適した試料系（例えば、揺らぎの大きな天然変性タンパク質、分子シャペロンHSP70など）のイメージングを検討する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Zernike Institut(オランダ)
• [Journal Article] An Efficient Method for Isolating and Purifying Nuclei from Mice Brain for Single-Molecule Imaging Using High-Speed Atomic Force Microscopy (2024)
  • Author(s): Qiu Yujia、Sajidah Elma Sakinatus、Kondo Sota、Narimatsu Shinnosuke、Sandira Muhammad Isman、Higashiguchi Yoshiki、Nishide Goro、Taoka Azuma、Hazawa Masaharu、Inaba Yuka、Inoue Hiroshiら
  • Journal Title: Cells Volume: 13 Issue: 3 Pages: 279-279
  • DOI: 10.3390/cells13030279
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Technical advances in high-speed atomic force microscopy (2023)
  • Author(s): Fukuda Shingo、Ando Toshio
  • Journal Title: Biophysical Reviews Volume: 15 Issue: 6 Pages: 2045-2058
  • DOI: 10.1007/s12551-023-01171-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Dynamics of E6AP E3 Ligase HECT Domain and Involvement of a Flexible Hinge Loop in the Ubiquitin Chain Synthesis Mechanism (2023)
  • Author(s): Takeda Kazusa、Flechsig Holger、Muro Ikumi、Amyot Romain、Kobayashi Fuminori、Kodera Noriyuki、Ando Toshio、Konno Hiroki
  • Journal Title: Nano Letters Volume: 23 Issue: 24 Pages: 11940-11948
  • DOI: 10.1021/acs.nanolett.3c04150
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nanoscopic Elucidation of Spontaneous Self-Assembly of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Open Reading Frame 6 (ORF6) Protein (2023)
  • Author(s): Nishide Goro、Lim Keesiang、Tamura Maiki、Kobayashi Akiko、Zhao Qingci、Hazawa Masaharu、Ando Toshio、Nishida Noritaka、Wong Richard W.
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry Letters Volume: 14 Issue: 38 Pages: 8385-8396
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.3c01440
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein dynamics by the combination of high-speed AFM and computational modeling (2023)
  • Author(s): Flechsig Holger、Ando Toshio
  • Journal Title: Current Opinion in Structural Biology Volume: 80 Pages: 102591-102591
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2023.102591
• [Journal Article] Nanoscopic Assessment of Anti-SARS-CoV-2 Spike Neutralizing Antibody Using High-Speed AFM. (2023)
  • Author(s): Keesiang Lim, Goro Nishide, Elma Sakinatus Sajidah, Tomoyoshi Yamano, Yujia Qiu, Takeshi Yoshida, Akiko Kobayashi, Masaharu Hazawa, Toshio Ando, Rikinari Hanayama, Richard W Wong
  • Journal Title: Nano letters Volume: 23 Issue: 2 Pages: 619-628
  • DOI: 10.1021/acs.nanolett.2c04270
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] PQBP5/NOL10 maintains and anchors the nucleolus under physiological and osmotic stress conditions (2023)
  • Author(s): Jin Xiaocen、Tanaka Hikari、Jin Meihua、Fujita Kyota、Homma Hidenori、Inotsume Maiko、Yong Huang、Umeda Kenichi、Kodera Noriyuki、Ando Toshio、Okazawa Hitoshi
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 1-20
  • DOI: 10.1038/s41467-022-35602-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of Hidden Markov Modeling of Molecular Orientations and Structures from High-Speed Atomic Force Microscopy Time-Series Images (2023)
  • Author(s): Tomonori Ogane, Daisuke Noshiro, Toshio Ando, Atsuko Yamashita, Yuji Sugita, Yasuhiro Matsunaga
  • Journal Title: PLoS Comp. Biol. Volume: 18 Issue: 12 Pages: e1010384-e1010384
  • DOI: 10.1371/journal.pcbi.1010384
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Actin-binding domain of Rng2 sparsely bound on F-actin strongly inhibits actin movement on myosin II (2022)
  • Author(s): Hayakawa Yuuki、Takaine Masak、Ngo Kien Xuan、Imai Taiga、Yamada Masafumi D、Behjat Arash Badami、Umeda Kenichi、Hirose Keiko、Yurtsever Ayhan、Kodera Noriyuki、Tokuraku Kiyotaka、Numata Osamu、Fukuma Takeshi、Ando Toshio、Nakano Kentaro、Uyeda Taro QP
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 6 Issue: 1 Pages: e202201469-e202201469
  • DOI: 10.26508/lsa.202201469
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Functional Implications of Dynamic Structures of Intrinsically Disordered Proteins Revealed by High-Speed AFM Imaging (2022)
  • Author(s): Ando Toshio
  • Journal Title: Biomolecules Volume: 12 Issue: 12 Pages: 1876-1876
  • DOI: 10.3390/biom12121876
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Spatiotemporal tracking of small extracellular vesicle nanotopology in response to physicochemical stresses revealed by HS-AFM. (2022)
  • Author(s): Elma Sakinatus Sajidah, Keesiang Lim, Tomoyoshi Yamano, Goro Nishide, Yujia Qiu, Takeshi Yoshida, Hanbo Wang, Akiko Kobayashi, Masaharu Hazawa, Firli R P Dewi, Rikinari Hanayama, Toshio Ando, Richard W Wong
  • Journal Title: Journal of extracellular vesicles Volume: 11 Issue: 11 Pages: 12275-12275
  • DOI: 10.1002/jev2.12275
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Guide to studying intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy (2022)
  • Author(s): Kodera Noriyuki、Ando Toshio
  • Journal Title: Methods Volume: 207 Pages: 44-56
  • DOI: 10.1016/j.ymeth.2022.08.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Visualization of intrinsically disordered proteins by high-speed atomic force microscopy. (2022)
  • Author(s): N. Kodera, T. Ando
  • Journal Title: Curr. Opin. Struct. Biol. Volume: 72 Pages: 260-266
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2021.11.014
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A high-speed piezoelectric Z-scanner with a resonance frequency above 1.1 MHz for high-speed atomic force microscopy. (2022)
  • Author(s): M. Shimizu, C. Okamoto, K. Umeda, S. Watanabe, T. Ando, N. Kodera
  • Journal Title: Rev. Sci. Instrum. Volume: 93 Issue: 1 Pages: 013701-013701
  • DOI: 10.1063/5.0072722
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High-speed atomic force microscopy reveals a three-state elevator mechanism in the citrate transporter CitS (2022)
  • Author(s): Maity Sourav、Trinco Gianluca、Buzon Pedro、Anshari Zaid R.、Kodera Noriyuki、Ngo Kien Xuan、Ando Toshio、Slotboom Dirk J.、Roos Wouter H.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 6 Pages: 1-9
  • DOI: 10.1073/pnas.2113927119
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Dual mechanism of EEA1-mediated vesicle fusion (2024)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Organizer: XXIII Linz Winter Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高速AFMの技術と応用に関する最近の動向 (2024)
  • Author(s): 安藤敏夫
  • Organizer: 第４回高速AFMオンラインシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Directly watching protein molecules in dynamic action by high-speed AFM (2023)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Organizer: The partnership for structural biology symposium "Dynamics in Structural Biology"
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡によるタンパク質の機能メカニズムの解明 (2023)
  • Author(s): 安藤敏夫
  • Organizer: サイエンステクノフロンティアフォーラム
  • Invited
• [Presentation] Directly observing protein molecules in dynamic action by high-speed atomic force microscopy (2022)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Organizer: Seminar at the Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research & Technology - Hellas (Crete, Greece)
  • Invited
• [Presentation] High-speed atomic force microscopy in biology (2022)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Organizer: Workshop on Computational Biophysics of Atomic Force Microscopy (Kanazawa)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ATP energy usage in biomolecular machinery (2022)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Organizer: Gordon Research Conference on single molecule approaches to biology (Castelldefels, Spain)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高速AFM技術について (2022)
  • Author(s): 安藤敏夫
  • Organizer: 第３回高速AFMオンラインシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡の仕組みと応用 (2022)
  • Author(s): 安藤敏夫
  • Organizer: 京都府中小企業技術センター 表面技術セミナー
  • Invited
• [Presentation] 液中生物ナノメーター世界の高速観察の実現 (2022)
  • Author(s): 安藤敏夫
  • Organizer: 日本生物物理学会 第９会総会シンポジウム (函館アリーナ）
  • Invited
• [Book] Chapter in "Encyclopedia of Solid-Liquid Interfaces" (2024)
  • Author(s): Linhao Sun, Shinji Watanabe and Toshio Ando
  • Total Pages: 14
  • Publisher: Elsevier
• [Book] High-speed Atomic Force Microscopy in Biology: Directly watching dynamics of biomolecules in action" (2022)
  • Author(s): Toshio Ando
  • Total Pages: 319
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 9783662647837
• [Remarks]
  • URL: https://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/index_J.htm
• [Remarks]
  • URL: https://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/index.htm
• [Remarks]
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/highlights/26581/
• [Remarks]
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/highlights/26357/
• [Remarks] 金沢大学 生物物理学グループへようこそ
  • URL: http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/index_J.htm
• [Remarks] Welcome to Kanazawa Biophysics Goup
  • URL: http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/index.htm
• [Remarks] NanoLSI Research Highlights
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/research/research-highlights/
• [Remarks] NanoLSI Research Highlights
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/research/research-highlights/