液－液相分離による「ねむり」制御の分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	22H00411
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	野田展生北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (40396297)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	戸田浩史筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (80862010)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥42,380,000 (Direct Cost: ¥32,600,000、Indirect Cost: ¥9,780,000) Fiscal Year 2024: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000) Fiscal Year 2023: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000) Fiscal Year 2022: ¥15,080,000 (Direct Cost: ¥11,600,000、Indirect Cost: ¥3,480,000)
Keywords	ねむり / 液－液相分離 / ショウジョウバエ / 天然変性タンパク質 / 液－液相相分離 / NMR
Outline of Research at the Start	睡眠は神経系を持つすべての動物に保存された現象であり、生命機能維持に不可欠であるが、その分子制御機構および本質的な機能は謎に包まれている。ショウジョウバエで同定された新規の睡眠誘因タンパク質‘Nemuri’は、睡眠制御の鍵を握ると考えられるが、その分子機能は全く不明である。Nemuriは天然変性タンパク質であることから、睡眠制御への液－液相分離の関与が強く示唆された。そこで本研究では、生化学、構造生物学、分子遺伝学、行動遺伝学を駆使して、Nemuriが持つ睡眠誘因活性と、相分離能力との関連を明らかにすることで、相分離という新規概念による睡眠制御機構の解明を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	睡眠は神経系を持つすべての動物に保存された必須の生命現象であり、生命体の機能維持に不可欠であるが、その分子制御機構および本質的な機能は謎に包まれている。ショウジョウバエの行動遺伝学スクリーニングから、新規の睡眠誘因活性を持つタンパク質‘Nemuri’が報告され、睡眠制御の鍵を握ると考えられるが、その分子機能は全く不明である。そこで本研究では、生化学、構造生物学、行動遺伝学等を用いてNemuriの性状と相分離能力の分子基盤を明らかにするとともに、それが睡眠誘因活性の発現にどう関係するのかを明らかにする。 Nemuriは天然変性タンパク質と予想され、安定なタンパク質を得るのが難しい。そこで安定化するためのタグを検討した結果、GB1タグを融合させることで安定したタンパク質として精製できることが明らかとなった。続いて15N標識GB1-Nemuriを調製し1H 15N HSQCスペクトルを測定した結果、Nemuriは配列からの予想通り全長にわたって天然変性状態であることが確かめられた。これまでに同定したNemuriと相互作用する新規因子について、ショウジョウバエのRNAiノックダウン実験を行い行動学的解析を行った結果、様々なストレス誘因性睡眠に重要であることが明らかとなった。そこでNemuriと新規因子の相互作用をAlphaFold2を用いて予測した結果、Nemuriは天然変性領域の一部をヘリックス構造へと変換することで新規因子と結合することが示唆された。さらにNMRを用いた相互作用解析を行った結果、Nemuriと新規因子は直接結合すること、その際Nemuriにはヘリックス構造が誘起されることが確かめられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 安定なNemuriタンパク質を調製する系の確立に成功し、NMR測定が出来る条件を決定した。そしてNemuri相互作用候補因子について、AlphaFold2とNMRを用いてNemuriと直接結合することを確認することに成功するなど、Nemuriとの結合を解析する系の確立に成功した。ショウジョウバエを用いた行動学的解析と並列で進めることで、順調に研究を進める体制が完成した。
Strategy for Future Research Activity	Nemuriと新規結合因子の詳細な相互作用様式をNMR法で明らかにし、その相互作用を破壊する変異体を設計する。そしてショウジョウバエを用いた行動学的解析により、その相互作用の破壊が睡眠誘引に与える影響を明らかにする。この一連の解析を他のNemuri結合因子候補群にも適用する。精製Nemuriの液－液相分離に新規結合因子が与える影響の解析も進める。