Ligand-dependent Wnt activation in malignant progression of gastric cancer

• Project/Area Number: 22H00454
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 50:Oncology and related fields
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 大島 正伸 金沢大学, がん進展制御研究所, 教授 (40324610)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥42,250,000 (Direct Cost: ¥32,500,000、Indirect Cost: ¥9,750,000); Fiscal Year 2025: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2024: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2023: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2022: ¥11,440,000 (Direct Cost: ¥8,800,000、Indirect Cost: ¥2,640,000)
• Keywords: 胃がん / マウスモデル / オルガノイド / Wntシグナル / 転移

Outline of Research at the Start

日本人の胃がん罹患率は高く、転移胃がん患者の５年生存率は6.6%と低い。したがって、転移性胃がんに対する新規治療薬開発のためにも胃がん悪性化進展機構の解明は重要である。胃がんでは、Wntシグナル活性化に至る遺伝子変異は少ないが、半数以上の胃がん由来オルガノイドは外因性Wntリガンド依存的に増殖することが報告された。以上の背景を基盤とし、本研究では個体レベルの研究により、リガンド依存的なWntシグナルによる胃がん悪性化進展機構を解明することを目的とする。そのため、Wntリガンド依存的な新規胃がんマウスモデル、オルガノイドモデルを開発し、胃がんの悪性化進展および転移巣形成機構の解析を行う。

Outline of Annual Research Achievements

東アジアにおける胃がん罹患率は欧米に比較して高く、日本における転移胃がん患者の５年生存率は約6%と極めて低い。そのため、転移性を獲得した悪性胃がんに対する新規治療法開発は喫緊の課題であり、胃がん転移機構の解明を目指した研究は重要である。正常幹細胞の維持に重要なWntシグナルは、遺伝子変異により恒常的に活性化すると、消化管上皮細胞は腫瘍化する。しかし、胃がん細胞ではWntシグナル活性化を誘導するAPCやCTNNB1などの遺伝子変異頻度は低く、半数以上の患者由来胃がんオルガノイドでは、外因性WntリガンドによるWntシグナル活性化が、がん細胞増殖に関与することが報告された。以上の背景を基盤とし、本研究ではマウスモデルおよびオルガノイドを用いた個体レベルの研究により、外因性リガンド依存的なWntシグナルによる、転移をともなう胃がん悪性化機構を解明することを目的とする。そのため、Kras（K）、Tgfbr2（T）、Trp53（P）遺伝子変異と、Wntリガンド発現（W）を組み合わせた新規胃がんマウスモデル、およびオルガノイドを樹立し、それらを用いた組織学的解析により、胃がん悪性化機構を解析する。
これまでの研究により、KTPマウスでは胃粘膜上皮の異形成と限定的な腫瘍性病変が見られるのに対し、WKTPマウスでは浸潤性胃がんが発生し、リガンド依存的なWntシグナル活性化が原発巣胃がん発生に重要である事を明らかにした。さらに、KTPオルガノイドは転移性を獲得していないのに対して、WKTPオルガノイドは脾臓移植により肝転移巣を高頻度に形成することから、外因性WntリガンドによるWnt活性化は、転移巣形成にも重要な役割を果たすことが明らかとなった

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Kras G12D変異（K）、Tgfbr2欠損（T）、Trp53 R270H変異（P）の３種類のドライバー遺伝子変異をさまざまな組み合わせで導入したマウスを作製した。これらのマウスと、胃粘膜上皮細胞でWntリガンド発現するK19-Wntマウスを交配し、各遺伝子変異マウス胃粘膜の病理解析により、以下の結果を得た。すなわち、KTP遺伝子変異マウスでは、胃粘膜上皮の粘液細胞化生と壁細胞の消失に加えて、軽度の異形成が見られたが、腫瘍性変化はほとんど見られなかった。一方でWntリガンド依存的にWntを活性化したWKTPマウスでは、胃粘膜で異形を伴う腫瘍細胞の増殖が認められ、粘膜下浸潤をともなう胃がんを発生した。
さらに、R5年度の研究により、KTPおよびWKTPマウス胃粘膜からオルガノイドを樹立し、それぞれマウス脾臓に移植して、肝転移巣形成について病理学的解析を行なった。その結果、KTPオルガノイドは肝臓類洞に到達しても生着せず、2週間後には腫瘍細胞が消失していたのに対して、WKTPオルガノイドは、肝臓類洞に到達後、線維化をともなう微小環境を形成して高頻度に転移巣を形成した。この結果により、外因性WntリガンドによるWnt活性化は、転移巣形成に重要な役割を果たすことが明らかとなった。そこで、内因性Wntシグナル活性化でも同様の転移巣形成効果が認められるか、検証するために、Apc遺伝子をCRISPR/Cas9で欠損させたKTP細胞（A-KTP細胞）を作製した。これまでに得られた予備的結果では、A-KTP細胞を脾臓に移植しても肝転移巣を形成しないことから、Wntリガンドによる間質細胞への作用が、転移巣形成に関与する可能性が考えられた。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究により、外因性Wntリガンド依存的なWntシグナル活性化は、ドライバー変異をともなう胃粘膜上皮細胞の異形成変化を誘導し、原発巣での浸潤性胃がん発生に重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに、腫瘍細胞が血流を介して肝臓類洞に到達した後の、微小環境形成と転移巣形成にも重要であることが明らかとなった。転移巣形成に、腫瘍細胞自身の内因性Wnt活性化が必要かを検証するため、Apc遺伝子を欠損したA-KTPオルガノイドを樹立して検証実験を始めており、R6年度は継続してA-KTPによる転移巣形成能について、移植実験と病理学的解析により検証する。
さらに、これまでのA-KTP移植による予備的結果から、肝臓の間質細胞でのWnt活性化が重要である可能性が考えられたため、WntリガンドcDNAの発現ベクターをKTP細胞に導入し、新たにW-KTP細胞を構築する。そして、KTP細胞とW-KTP細胞をそれぞれマウスに脾臓移植し、肝転移巣形成について病理学的解析を実施する。KTPが転移しないのに対して、Wntリガンドを発現するW-KTPが転移能を獲得した場合、こ外因性Wntリガンドによる間質細胞でのWntシグナル活性化が、胃がん転移巣形成に必要である可能性が示唆され、A-KTP細胞が転移巣を形成しない結果とも一致する。以上は、本研究開始当初は予想していなかった、重要な発見となる。
以上の結果が得られた場合、転移巣間質で実際にWntシグナルが活性化しているのかについて、WKTP細胞の転移巣組織標本を用いた、空間トランスクリプトーム解析を実施して検証する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] IRCCS San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
• [Journal Article] Gain-of-Function p53 Mutation Acts as a Genetic Switch for TGFβ Signaling-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Intestinal Tumors (2023)
  • Author(s): Wang Dong、Nakayama Mizuho、Hong Chang Pyo、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • Journal Title: Cancer Research Volume: 84 Issue: 1 Pages: 56-68
  • DOI: 10.1158/0008-5472.can-23-1490
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genetic and nongenetic mechanisms for colorectal cancer evolution (2023)
  • Author(s): Kok Sau Yee、Nakayama Mizuho、Morita Atsuya、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 9 Pages: 3478-3486
  • DOI: 10.1111/cas.15891
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In Vitro and In Vivo Models for Metastatic Intestinal Tumors Using Genotype-Defined Organoids (2023)
  • Author(s): Morita Atsuya、Nakayama Mizuho、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • Journal Title: Methods in Molecular BIology Volume: 2691 Pages: 19-30
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-3331-1_2
  • ISBN: 9781071633304, 9781071633311
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In vivo macrophage engineering reshapes the tumor microenvironment leading to eradication of liver metastases (2023)
  • Author(s): Kerzel T、Giacca G、Beretta S、Bresesti C、Notaro M
  • Journal Title: Cancer Cell Volume: 41 Issue: 11 Pages: 1892-1910.e10
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2023.09.014
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Frequent loss of metastatic ability in subclones of <i>Apc</i> , <i>Kras</i> , <i>Tgfbr2</i> , and <i>Trp53</i> mutant intestinal tumor organoids (2023)
  • Author(s): Morita Atsuya、Nakayama Mizuho、Wang Dong、Murakami Kazuhiro、Oshima Masanobu
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 4 Pages: 1437-1450
  • DOI: 10.1111/cas.15709
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nano-scale physical properties characteristic to intestinal cancer cells identified by high speed-scanning ion conductance microscope (2022)
  • Author(s): D. Wang, L. Sun, S. Okuda, D. Yamamoto, M. Nakayama, H. Oshima, H. Saito, Y. Kouyama, K. Mimori, T. Ando, S. Watanabe, M. Oshima
  • Journal Title: Biomaterials Volume: 280 Pages: 121256-121256
  • DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.121256
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Characterization of RNF43 frameshift mutations that drive Wnt ligand‐ and R‐spondin‐dependent colon cancer (2022)
  • Author(s): Yamamoto Daisuke、Oshima Hiroko、Wang Dong、Takeda Haruna、Kita Kenji、Lei Xuelian、Nakayama Mizuho、Murakami Kazuhiro、Ohama Takashi、Takemura Hirofumi、Toyota Mutsumi、Suzuki Hiromu、Inaki Noriyuki、Oshima Masanobu
  • Journal Title: The Journal of Pathology Volume: 257 Issue: 1 Pages: 39-52
  • DOI: 10.1002/path.5868
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Stem Cells, Helicobacter pylori, and Mutational Landscape: Utility of Preclinical Models to Understand Carcinogenesis and to Direct Management of Gastric Cancer (2022)
  • Author(s): Liabeuf Dylan、Oshima Masanobu、Stange Daniel E.、Sigal Michael
  • Journal Title: Gastroenterology Volume: 162 Issue: 4 Pages: 1067-1087
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2021.12.252
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Genetic Alterations and Microenvironment that Drive Malignant Progression of Colorectal Cancer: Lessons from Mouse and Organoid Models (2022)
  • Author(s): Nakayama Mizuho、Wang Dong、Kok Sau Yee、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • Journal Title: Journal of Cancer Prevention Volume: 27 Issue: 1 Pages: 1-6
  • DOI: 10.15430/jcp.2022.27.1.1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Genetically engineered tumor-derived organoid models to examine the metastasis mechanism of gastrointestinal cancer (2023)
  • Author(s): Oshima H, Kok SY, Nakayama M, Ikeda Y, Matsunaga YT, Oshima M.
  • Organizer: 41st Sapporo International Cancer Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Gain-of-function mutant p53 for activin signaling-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) (2023)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: 10th International MDM2 Workshop
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Identification of genotype-linked nano-scale physical properties of intestinal tumor cells (2023)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: 7th WPI-NanoLSI International Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Organoid experiments to understand the metastasis mechanism (2023)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: 5th National Cancer Center (NCC)-GCSP Inter-Academy Cancer Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Collective migration and polyclonal metastasis mechanism (2023)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: Seoul International Gastric Cancer Forum 2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 腸管腫瘍の悪性化におけるKrasG12D変異の役割 (2023)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 京都大学iCeMSシンポジウム，変異KRAS分子標的薬の開発と将来への展望
  • Invited
• [Presentation] Cancer evolution by positive and negative selection (2023)
  • Author(s): Oshima M, Kok SY, Wang D, Nakayama M, Oshima H
  • Organizer: 第20回幹細胞シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] マウス胃がんオルガノイドによるWntリガンド依存的な悪性化機構の検討 (2023)
  • Author(s): 大島浩子，古谷裕一郎，中山瑞穂，稲木紀幸，大島正伸
  • Organizer: 第82回日本癌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] 消化器がん発生と悪性化進展を促進する炎症性微小環境 (2023)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 第15回In vivo実験医学シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Modeling polyclonal metastasis of colon cancer by organoids (2022)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: 115th Annual Meeting of American Association of Cancer Research
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Preclinical model of cholangiocarcinoma by cooperation of oncogenic activation and COX-2/PGE2-assocaited inflammation (2022)
  • Author(s): Oshima H, Nakayama M, and Oshima M
  • Organizer: 7th JCA-AACR Special Joint Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Polyclonal metastasis of genetically and phenotypically distinct intestinal tumor oganoids (2022)
  • Author(s): Oshima M
  • Organizer: 12th AACR-JCA Joint Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 大腸がんのポリクローナル転移と線維性微小環境 (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 第46回日本リンパ学会総会
  • Invited
• [Presentation] 消化器がんの発生と悪性化における宿主反応 マウスモデルからの知見 (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 第26回日本がん分子標的治療学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] 消化器がんの発生・悪性化における炎症反応 (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 第124回北海道癌談話会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Wnt signaling-dependent malignant progression of gastric cancer (2022)
  • Author(s): Oshima H, Nakayama M, Terakado Y, Oshima M
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] Modeling development and malignant progression of intestinal tumors in mice (2022)
  • Author(s): Oshima M, Wng D, Nakayama M, Oshima H
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
  • Invited
• [Presentation] The mechanisms of Wnt hyperactivation in intestinal tumor cells that carry gain-of-function p53 mutation (2022)
  • Author(s): Nakayama M, Oshima H, Oshima M
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Activin promote intestinal tumor cell metastasis by interacting with gain-of-function mutant p53 (2022)
  • Author(s): Wang D, Nakayama M, Oshima H, Oshima M
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Heterogeneity of liver metastatic ability in the same driver gene mutations of colorectal cancer (2022)
  • Author(s): Morita A, Nakayama M, Oshima H, Oshima M
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] マウスモデルから見る消化器がんの発生と悪性化 (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Organizer: 第35回発癌病理研究会
  • Invited
• [Book] リンパ学 (2023)
  • Author(s): 大島浩子，中山瑞穂，大島正伸
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 日本リンパ学会
• [Book] 別冊・医学のあゆみ「基盤病態としての慢性炎症」 (2023)
  • Author(s): 大島浩子，中山瑞穂，大島正伸
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] 病理と臨床「がんゲノム医療時代の分子腫瘍学」 (2022)
  • Author(s): 中山瑞穂，大島浩子，大島正伸
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 文光堂
• [Book] 実験医学「臨床実装が進む次世代がんバイオマーカー」 (2022)
  • Author(s): 中山瑞穂，大島正伸
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 羊土社
• [Book] 医学のあゆみ (2022)
  • Author(s): 大島浩子，中山瑞穂，大島正伸
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 医歯薬出版
• [Book] Bio Clinica (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 北隆館
• [Book] 実験医学 (2022)
  • Author(s): 大島正伸
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 羊土社
• [Remarks] 金沢大学がん進展制御研究所 腫瘍遺伝学研究分野HP
  • URL: http://genetics.w3.kanazawa-u.ac.jp/
• [Remarks] 金沢大学がん進展制御研究所 腫瘍遺伝学研究分野HP
  • URL: http://genetics.w3.kanazawa-u.ac.jp