分子・構造変換のリアルタイム可視化からの病気の解明と治療戦略
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22H00456
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 50:Oncology and related fields
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
渡邊 直樹 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (80303816)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥42,380,000 (Direct Cost: ¥32,600,000、Indirect Cost: ¥9,780,000)
Fiscal Year 2024: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,910,000 (Direct Cost: ¥10,700,000、Indirect Cost: ¥3,210,000)
Fiscal Year 2022: ¥16,120,000 (Direct Cost: ¥12,400,000、Indirect Cost: ¥3,720,000)
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| Keywords | キナーゼ阻害薬 / アロステリック効果 / 逆説的活性化 / 細胞分子イメージング / 超解像顕微鏡 / 多重細胞マーカー検出 / 抗体改変技術 / アクチンオリゴマー |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内分子の動態をリアルタイムに捕捉する先行研究から、生体の分子や構造にはむやみに活性化しない抑制が強くかかっており、その解除ステップががん、神経変性、物理ストレス応答に大きな役割を果たすことがわかってきた。特に、分子標的薬であるキナーゼ阻害薬が標的キナーゼをコンフォメーション上活性化する機構の発見は、がんの薬剤抵抗性の克服に向けて新たに取り組むべき課題を提起している。本研究では、蛍光単分子イメージングや独自の多重超解像顕微鏡IRISを発展させ、生体の分子や細胞構造の崩れから再構成に至る過程を捕捉する手法を開拓し、分子病理の解明および治療薬の作用メカニズム解明と開発への応用を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体分子や構造にはむやみに活性化しない強い抑制機構があり、その破綻が異常なシグナル伝達を引き起こすという仮説に基づき、その過程を高精度イメージングを中心とした技術を用いることで解き明かす研究を展開した。まず、がん関連キナーゼの抑制制御の解除機構について、Erkシグナルの活性化を指標にしたアッセイ構築に一部成功した。間違った活性化を起こしうる薬剤とキナーゼの組合せのスクリーニングを試みている。細胞構造の崩れについては、細胞内アクチン線維崩壊後にできるオリゴマーアクチンの形成過程、細胞仮足内での拡散および移動の様式について新知見を捉えつつある。一方、コフィリン－アクチンロッド形成の細胞内可視化による神経ストレスシグナルの解析については、コフィリンGFPの過剰発現と光励起刺激に依存した非常に強いロッド形成誘導が再現性よく観察されるものの、それと比較すると、ATP枯渇や酸化ストレスといった神経毒性のモデル環境変化による効果が小さすぎ、病態検証へこの指標を応用することが困難であることが判明した。計画を練り直し中である。生体微細構造を可視化する独自の多重超解像顕微鏡IRISについては、2022年度大きな技術的進展があった。個別の可視化用プローブを既存のモノクローナル抗体・ナノボディから迅速に改良・作製する手法を開発に成功し、論文にまとめ報告した。引き続き、機器も改良することで、IRISの原理を利用した細胞や生体組織標本内で数１０種類の細胞マーカーを自動撮像・検出可能な解析系の開発に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
生体微細構造の形状や分子複合体の構成分子を忠実に可視化可能な独自の多重超解像顕微鏡IRISについて、2022年度に大きな技術的進展があった。原理的に既存の超解像を凌駕する画像忠実度と無制限の多重染色を実現するIRISであるが、観察対象に対し個別の可視化用プローブを得ることが以前は困難であった。そこで、既存のモノクローナル抗体・ナノボディをリコンビナント化し、高い成功率で迅速にプローブに変換する手法を開発に取り組み成功した（2022年Cell Reports Methods誌に報告）。同手法によるIRIS用蛍光プローブは、未発表のものも含め、約30種に達しており、今後急速に増える予定である。加えて、細胞や生体組織標本内で数１０種類の細胞マーカーを自動撮像・検出する解析装置開発に向けての予備データ収集が進んでいる。キナーゼ阻害薬によるアロステリックな標的分子の活性化と下流シグナルの逆説的な活性化については、細胞を用いたキナーゼと阻害薬の組合せをスクリーニングするアッセイをいくつか検討のうえ、小規模のスクリーニングに取り組んでいる。細胞構造の崩壊過程については、細胞内仮足における速いアクチン脱重合に続いて生成されると考えられる中間体、アクチンオリゴマーの生成過程や細胞内挙動を解析し、その拡散や移動に関する新知見が得られた。現在、その生理的意義およびメカニズムについて、精査中である。関連して、細胞先導端の葉状仮足のアクチン重合端がブラウンラチェット機構を介した力覚センサーとして働き、細胞外からのけん引力に向かって進展する独自の発見について理論的に補強する論説を出版した。さらに、葉状仮足のアクチン求心性流動にさらされた接着斑分子を単分子イメージングで解析し、新しい力の伝達に必要な分子性質を明らかにした（一部、投稿中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
キナーゼ阻害薬とアロステリック制御キナーゼの組合せをスクリーニングするためのアッセイの開発を引き続き行う。現時点で、阻害薬が活性化する逆説的シグナルを捉えることに一部成功している。さらに、細胞イメージングや生化学的アッセイに加え、二量体化依存性GFPや循環置換GFPをキナーゼドメイン近傍・周囲に挿入、薬剤結合により蛍光変化を来すプローブも開発する。これらを改良し、下流の細胞シグナルの間違った活性化を起こしうる薬剤とキナーゼの組合せをスクリーニングすることを試みる。細胞構造の崩れについては、トリガーとなる細胞内外からの物理ストレスの伝播様式を蛍光単分子イメージングによって可視化解析する。細胞内アクチン線維崩壊後にできるオリゴマーアクチンの形成過程とラメリポディア内での拡散移動様式、結合分子について新知見を捉えつつあり、機能的意義の解明を進めている。一方、コフィリン－アクチンロッド形成の細胞内可視化については、上述したように病態検証への利用が困難であることが判明した。よって、計画を練り直すこととした。加えて、本年度は独自の多重超解像顕微鏡IRISの応用拡張に注力する。前年度発表した既存のモノクローナル抗体・ナノボディからの迅速プローブ開発を応用し、IRISで可視化できる対象分子を多数増やす。生体標本の多重染色超解像による先導的な構造学的解析を遂行し、次世代レベルの生体超構造の知見を得ることに挑む。同時に、長時間撮像が必要なIRISに最適化された顕微鏡制御や自動還流の追加などによる装置改良に努め、IRISの原理を応用する細胞・生体組織の固定標本内で数１０種類もの細胞マーカーを容易に検出可能な装置の開発も進める予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(18 results)
