Elucidation of molecular mechanism of enamel formation and application to non-cellular hard tissue regeneration

• Project/Area Number: 22H00488
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 福本 敏 九州大学, 歯学研究院, 教授 (30264253)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉崎 恵悟 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10507982) ; 山田 亜矢 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (40295085) ; 千葉 雄太 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10821986)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥41,990,000 (Direct Cost: ¥32,300,000、Indirect Cost: ¥9,690,000); Fiscal Year 2024: ¥8,190,000 (Direct Cost: ¥6,300,000、Indirect Cost: ¥1,890,000); Fiscal Year 2023: ¥8,190,000 (Direct Cost: ¥6,300,000、Indirect Cost: ¥1,890,000); Fiscal Year 2022: ¥10,790,000 (Direct Cost: ¥8,300,000、Indirect Cost: ¥2,490,000)
• Keywords: エナメル芽細胞 / 歯の再生 / 歯原性上皮細胞 / 石灰化 / 歯の発生 / エナメル質

Outline of Research at the Start

歯の最表層に存在するエナメル質は生体内で最も硬い組織であるが、齲蝕などにより破壊されると再生させることが困難であり、現在は人工物での修復が行われている。一度破壊されたエナメル質を再生させる技術を開発するために、エナメル質の石灰化の分子メカニズムを明らかにすることが本研究の目的である。またiPS細胞などの細胞を用いた歯の再生技術はある程度確立されてきたが、口腔内でのエナメル質再生には細胞を用いない方法で行う必要がある。そこで細胞に依存しないエナメル質再生の基盤技術の確立を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

生体内で最も硬いエナメル質の再生は、硬組織再生の中でも極めて難しい課題あり、一度喪失したエナメル質は再生は不可能であることから、人工物を用いた修 復が行われている。先天的なエナメル質形成不全や、齲蝕等による後天的なエナメル質破壊に対し、新たな治療法としてのエナメル質再生技術は、次世代歯科再 生療法として期待される。しかしながらエナメル質形成に関わるエナメル芽細胞分化に関しては未だ不明な部分も多く、特に成熟期エナメル芽細胞の機能に関し ては、ほとんど解明されていないのが現状である。そこで本研究では、歯の形成過程における歯原性上皮細胞の各種細胞(内外エナメル上皮、中間層細胞、星状網 細胞)への分化機構の解明、その中でも内エナメル上皮から分化するエナメル芽細胞の成熟過程における石灰化機構を明らかにし、これらの知見を用いた新たな 「エナメル質再生」ならびに「細胞に依存しない硬組織再生」技術の開発を目的としている。
これまで成熟期エナメル芽細胞に発現し、エナメル質の石灰化に関与していることが示唆されたGpr111およびGpr115の欠損マウスが、pH調節機構がうまく働かずに石灰化が十分に生じないことを見出した。そこで個々の分子における機能解析を行った結果、Gpr115はCar6の発現抑制を、Gpr111はKlk4の発現制御によるエナメル基質の分解に関与することが示唆されたが、これらは独立してpHに応答することがわかり、Gpr115はpH低下に依存してGpr111はpH6.8を閾値として作用していることが新たに判明した。Gpr111およびGpr115の２重欠損マウスにおいては、双方の表現系が相乗的ではなく相加的であり、pHにより応答性と同様に機能自体の重複はなく、独自にエナメル芽細胞の成熟期機能の維持に貢献していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度に引き続き、エナメル質の石灰化に関わるGpr111およびGpr115の機能解析において、これらの分子が連動して作用しているのか、独立して作用しているのか不明であった。今年度の研究においては、双方の２重欠損マウスの解析から、エナメル質形成の表現系が、単独の遺伝子欠損マウスと比較して相加的であり、独立して作用している可能性が示唆された。Gpr111およびGpr115が、細胞外のpHの変化に応じてその発現を変化させ、さらに下流分子のCar6およびKlk4の発現を制御しているが、これらGprがpHに関わる水素イオンの直接的な受容体（センサー）となっているのかに関しては、明らかにすることができなかった。一方で、歯発生段階におけるscRNAシークエンス解析から、Gpr以外にも成熟期エナメル芽細胞の機能維持に重要な分子のスクリーニングができたことから、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

１）Gpr111およびGpr115のより詳細な機能解析のために、Gpr111欠損マウス、Gpr115欠損マウス、Gpr111およびGpr115の２重欠損マウスの歯胚サンプルを用いたRNAシークエンスおよびCAGE解析により、エナメル質形成過程におけるpH調整機構の詳細を明らかにする。さらにリコンビナントCar6およびKlk4タンパクを作成し、これらを用いることでin vitroでのエナメル質石灰化モデルにおけるエナメル質の基質含有量やハイドロキシアパタイト形成量の評価を行う。
２）新規エナメル質成熟過程に発現する分子の機能解析を行うため（組織内発現は確認済み）、これら分子を欠損させた歯原性上皮細胞株を作成し、エナメル芽細胞の分化評価を行う。エナメル芽細胞の分化に直接関与する分子について、遺伝子改変マウス等を作成し、エナメル質石灰化における役割についての詳細な解析を行う。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 北京大学(中国)
• [Int'l Joint Research] 延世大学(韓国)
• [Int'l Joint Research] National Institute of health(米国)
• [Int'l Joint Research] 米国国立衛生研究所(米国)
• [Journal Article] Mediator 1 ablation induces enamel-to-hair lineage conversion in mice through enhancer dynamics. (2023)
  • Author(s): Thaler R, Yoshizaki K, Nguyen T, Fukumoto S, Den Besten P, Bikle DD, Oda Y.
  • Journal Title: Commun Biol. Volume: 6(1) Issue: 1 Pages: 766-766
  • DOI: 10.1038/s42003-023-05105-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Deficiency of G protein‐coupled receptor <i>Gpr111/Adgrf2</i> causes enamel hypomineralization in mice by alteration of the expression of kallikrein‐related peptidase 4 ( <i>Klk4</i> ) during <scp>pH</scp> cycling process (2023)
  • Author(s): Chiba Yuta、Yoshizaki Keigo、Sato Hiroshi、Ikeuchi Tomoko、Rhodes Craig、Chiba Mitsuki、Saito Kan、Nakamura Takashi、Iwamoto Tsutomu、Yamada Aya、Yamada Yoshihiko、Fukumoto Satoshi
  • Journal Title: The FASEB Journal Volume: 37 Issue: 4
  • DOI: 10.1096/fj.202202053r
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of a novel ex vivo organ culture system to improve preservation methods of regenerative tissues (2023)
  • Author(s): Yuta T, Tian T, Chiba Y, Miyazaki K, Funada K, Mizuta K, Fu Y, Kawahara J, Iwamoto T, Takahashi I, Fukumoto S, Yoshizaki K.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 13(1) Issue: 1 Pages: 3354-3354
  • DOI: 10.1038/s41598-023-29629-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of GPI-anchored protein LYPD1 as an essential factor for odontoblast differentiation in tooth development (2023)
  • Author(s): Fu Y, Miyazaki K, Chiba Y, Funada K, Yuta T, Tian T, Mizuta K, Kawahara J, Zhang L, Martin D, Iwamoto T, Takahashi I, Fukumoto S, Yoshizaki K.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 299(5) Issue: 5 Pages: 104638-104638
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2023.104638
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enamel defects of Axenfeld‐Rieger syndrome and the role of PITX2 in its pathogenesis (2022)
  • Author(s): Yang Yi、Zhu Junxia、Chiba Yuta、Fukumoto Satoshi、Qin Man、Wang Xin
  • Journal Title: Oral Diseases Volume: in press Issue: 8 Pages: 3654-3664
  • DOI: 10.1111/odi.14315
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] GSK3beta inhibitor-induced dental mesenchymal stem cells regulate ameloblast differentiation (2022)
  • Author(s): Yamada Aya、Yoshizaki Keigo、Saito Kan、Ishikawa Masaki、Chiba Yuta、Hoshikawa Seira、Chiba Mitsuki、Hino Ryoko、Maruya Yuriko、Sato Hiroshi、Masuda Keiji、Yamaza Haruyoshi、Nakamura Takashi、Iwamoto Tsutomu、Fukumoto Satoshi
  • Journal Title: Journal of Oral Biosciences Volume: 64 Issue: 4 Pages: 400-409
  • DOI: 10.1016/j.job.2022.10.002
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Molecular mechanism of enamel mineralization regulated by GPR111 and GPR115 (2024)
  • Author(s): 福本 敏
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会
  • Invited