| Project/Area Number |
22H00593
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
山吉 麻子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (70380532)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
徳田 崇 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (50314539)
駒野 淳 大阪医科薬科大学, 薬学部, 教授 (60356251)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥42,120,000 (Direct Cost: ¥32,400,000、Indirect Cost: ¥9,720,000)
Fiscal Year 2025: ¥10,530,000 (Direct Cost: ¥8,100,000、Indirect Cost: ¥2,430,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,140,000 (Direct Cost: ¥7,800,000、Indirect Cost: ¥2,340,000)
Fiscal Year 2023: ¥9,490,000 (Direct Cost: ¥7,300,000、Indirect Cost: ¥2,190,000)
Fiscal Year 2022: ¥11,960,000 (Direct Cost: ¥9,200,000、Indirect Cost: ¥2,760,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / 核酸医薬 / 光操作 / 光架橋性核酸 / レトロウイルス感染症 / ウイルス感染症 / ソラレン / HTLV-1 / 光応答性核酸 |
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| Outline of Research at the Start |
独自に開発した光架橋性核酸医薬（Light-Scissors）を駆使することで、光をトリガーとした新しいレトロウイルス遺伝子の不活性化法の開発を目指す。Light-Scissorsは標的遺伝子に対して配列特異的に架橋反応を誘導するため、DNAの複製過程が阻害されることに伴って二重鎖切断が誘起され、欠損変異等が導入されると期待される。様々な新規光架橋性核酸を合成し、そのゲノム編集活性を培養細胞系でスクリーニングする。さらに in vivo 光照射デバイスの開発にも注力し、in vivo での光ゲノム編集技術によるプロウイルス遺伝子の不活性化効果についても検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. Light-Scissorsの分子構造の最適化（山吉）
2022年度、我々の研究グループでは、人工核酸に光架橋性を付与できる化合物の開発に成功した。今年度（2023年度）はこの化合物を用い、次世代ゲノム編集ツールとして期待されているペプチド核酸に光架橋性を付与し、標的遺伝子との結合親和性や光架橋能を評価した。その結果、tail-clamp型PNA にソラレンを導入した核酸でのみ、中性条件下での標的遺伝子との結合と架橋が認められた。このため、ソラレン導入tail-clamp型PNA （Ps-tc-PNA）を細胞系等の実験に用いることとした。
2. Light-Scissors のゲノム編集効率の評価（モデル細胞系）（駒野、山吉）
ゲノム編集効率を迅速評価するためのルシフェラーゼ発現プラスミドを構築した。このプラスミドは、通常時は Firefly Luciferase（FF Luc）活性のみ観察されるが、Ps-tc-PNAによるゲノム編集が起こると、FF Luc活性が減少し、 Renilla Luciferase（R Luc）活性が回復する。この評価系を用い、モデル配列を標的としたPs-tc-PNAによるゲノム編集効率を評価した結果、UV照射時のみ、FF Luc活性が減少し、R Luc活性が回復した。これらのデータより、Ps-tc-PNAを用いて生細胞中でのゲノム編集が達成されたことが示された。また、Ps-tc-PNA の配列の向きによって、誘起されるゲノム編集が異なることも示された。
3. in vivo展開を可能とする光照射装置の開発（徳田、山吉）
主要なリンパ系組織に照射可能なLED形状のUV光照射装置を開発し、体内埋入実験を行った。柔軟な平面型光刺激デバイスを組み合わせ、新しい体内埋入型光照射装置を開発した。現在、in vivo での埋入実験、照度の検証を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度、生細胞中でのゲノム編集を実現する新たな Light-Scissors を開発することに成功した。さらに、PNAの配列の方向性により、ゲノム編集効率を操作できる可能性も示された。今後、DNA修復機構と照らし合わせて考察することで、新たな遺伝子制御ツールの開発も見込まれる。
さらに、ゲノム編集の迅速評価系を用い、プロウイルス遺伝子を標的とした Light-Scissors の開発にも着手している。in vivo光照射デバイスも完成したことから、当初の計画以上に進展していると言うことができる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. Light-Scissorsの分子構造の最適化（山吉）
既に様々な化学構造を持つLight-Scissorsの開発に成功しており、あらゆる人工核酸に光架橋性を付与することを可能とする化合物の開発にも成功した（2023年 PCT出願済）。この化合物を用い、次世代ゲノム編集ツールとして期待されているペプチド核酸に光架橋性を付与し、標的遺伝子との結合親和性や光架橋能を網羅的に評価する。2023年度までの検討により、細胞内で光ゲノム編集を実現する人工核酸の開発にも成功しているため、分子設計のさらなる最適化をはかる。
2. Light-Scissors のゲノム編集効率の評価（モデル細胞系）（駒野、山吉）
2023年度までに、Light-Scissors を用いたゲノム編集効率を評価する実験系として、宿主細胞からのプロウィルスゲノムの除去効率を迅速評価できるルシフェラーゼレポータアッセイを構築することに成功し、前項目（1）で合成したLight-Scissorsのゲノム編集効率を評価してきた。昨年度まではモデル配列を用いた検討に注力してきたが、2024年度はHTLV-1プロウイルス遺伝子に対して結合する三重鎖形成核酸を新たに設計し、これにソラレンを導入したLight-Scissors を合成し、プロウイルスゲノム除去効率の評価、光照射によるその時空間的制御について検討する。
3. in vivo展開を可能とする光照射装置の開発（徳田、山吉）
2023年度までに、柔軟な平面型光刺激デバイスをのプロトタイプとして、ポリイミドフレキシブル基板およびLEDチップを組み合わせ、新しい体内埋入型光照射装置を開発してきた。その結果、より柔軟性を持たせたデバイスが in vivo埋入に良好であることが判明したため、基盤の在室や形状についてさらなる改良をはかる。
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