インテグリンによる細胞相互作用の可塑性と堅牢性の生成メカニズムと生体機能の解明
Project/Area Number |
22H02623
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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Research Institution | Kansai Medical University |
Principal Investigator |
木梨 達雄 関西医科大学, 医学部, 学長 (30202039)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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Keywords | cell adhesion / integrins / Rap1 / talin / kindlin3 / 細胞接着 / インテグリン |
Outline of Research at the Start |
インテグリンは細胞接着を制御することによって細胞外環境との相互作用を変化させ、細胞形態、細胞移動や機能、増殖等に重要な役割を担っている。この制御には低分子量G蛋白質Rap1、インテグリン結合蛋白質talin、kindlinを中心とする双方向性シグナル伝達が必要である。この研究では、申請者らが見出した双方向性シグナル伝達によってインテグリンLFA1による接着が変化するメカニズム、および、リンパ球の血管内皮、抗原提示細胞との接着、移動などの過程に生じる接着の可塑性と堅牢性の生成過程を明らかにする。
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Outline of Annual Research Achievements |
(1)インテグリンを調節する分子間の細胞内結合動態と接着誘導の解明: 細胞外LFA1と細胞内α4β1, α4β7, αIIbβ3 のキメラ分子を作成・BAF細胞に導入後、結合過程の一分子イメージングによる結合動態解析を行った。高親和性細胞外LFA1をmAb24で誘導し細胞内領域(CT)をβ2からβ1,β7に置換したキメラ分子とtalin1との結合はβ7がもっとも弱く、β2がもっとも強いことが明らかになった。 (2)ローリング、一過性停止(tether)、安定した停止(arrest)の動態変化をする実験系を用いて、遺伝子欠損T細胞の解析からtalin1、kindlin3、Rap1a/Rap1b、Rap1活性化因子 (RasGRP2, C3G)がCCL21による停止に必須であった。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のキャプチャーからRap1が活性化し、遺伝子欠損T細胞の解析から, ローリングの安定化(速度低下)にはRap1、talin1が必要であるが、kindlin-3は必要ないこと、停止接着にはRap1, talin1, kindlin-3が必要であることが明らかになった。 (3)細胞極性および細胞接着・移動の制御過程を明らかにする。 前年度の解析結果から接着非依存性のCCL21によるT細胞の細胞極性をimaging cytometryおよびAIによる数万の画像解析の自動化によってRap1依存性を同定した。さらにRap1はDOCK2/Racによるアクチン骨格の成長(pseudopod)に依存してC3G/RasGRP2が活性しRap1の活性化を誘導することが明らかになった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでtalinとインテグリンの細胞内領域の動態を計測する手段はなかったが、一分子計測によって細胞内talin結合動態解析が可能となり、talinと会合頻度および結合時間が計測可能となった。さらに、αLβ2(LFA1)のαL鎖およびβ2鎖の細胞内領域を他のβ1, β3, β7インテグリンの細胞内領に置換し細胞に発現させ、抗体もしくはMn2+による高親和性LFA1を誘導した際のtalin1結合動態測定系を樹立し、talin1の結合動態が実測できるようになった。β2鎖がもっとも強くtalin1に結合をしたことから、今後その原因を追究することが求められる。 また、この結果はL-selectin/PNAdおよびLFA1/ICAM1による白血球接着カスケードとα4β7/MAdCAM1によるそれとの比較をする際に重要な知見をもたらした。特に後者のローリングはRap1、talin1が必要ではなく、おそらく構造的な柔軟性によりα4β7単独でローリングを行い、停止のときにtalin1が関与する。一方、LFA1/ICAM1によるローリングにはtalin1の結合が必要であることから、talin1と細胞内領域との結合親和性が調節の鍵になっていることが示唆される。リンパ球細胞極性におけるRap1の必要性についてはAIによる判定系が樹立でき、定量的に形態計測が可能になったことから、Rap1の上流シグナルの評価が明確にできるようになった。
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Strategy for Future Research Activity |
およそ計画通りに進める予定である。β7とβ2の部分キメラを作成し、結合力の差が生じている領域を同定する。また、talin1の結合部位についてpull-down アッセイなどを用いて同定する。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のリンパ球のキャプチャーからローリング、停止接着に至る過程でRap1活性化およびtalin1の膜への集積のタイミングを明らかにする。リンパ球細胞極性についてはtalin1, kindlin-3, RIAM欠損T細胞、およびhalotag-talin1 knock-in T細胞を用いて、インテグリン非依存性の細胞極性誘導のメカニズムを明らかにする。
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Report
(1 results)
Research Products
(7 results)