| Project/Area Number |
22H04979
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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Broad Section F
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武藤 倫弘 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30392335)
國澤 純 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 ヘルス・メディカル微生物研究センター, センター長 (80376615)
椙村 春彦 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00196742)
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| Project Period (FY) |
2022-04-27 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥184,990,000 (Direct Cost: ¥142,300,000、Indirect Cost: ¥42,690,000)
Fiscal Year 2025: ¥35,880,000 (Direct Cost: ¥27,600,000、Indirect Cost: ¥8,280,000)
Fiscal Year 2024: ¥35,880,000 (Direct Cost: ¥27,600,000、Indirect Cost: ¥8,280,000)
Fiscal Year 2023: ¥36,400,000 (Direct Cost: ¥28,000,000、Indirect Cost: ¥8,400,000)
Fiscal Year 2022: ¥40,950,000 (Direct Cost: ¥31,500,000、Indirect Cost: ¥9,450,000)
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| Keywords | コリバクチン / 大腸がん / 遺伝毒性物質 / 天然物 / スクリーニング / 生合成 / 発がんメカニズム / モノクローナル抗体 / 大腸菌 / がん化学予防法 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、大腸がん予防法の確立に始まり、発症メカニズムの解明、大腸がんの治療法といった様々な分野に波及効果を及ぼすことが期待でき、社会に対して直接的に大きなインパクトを示すと確信する。コリバクチン研究で得られる知見は、腸内細菌が持つ毒素生合成遺伝子群の活性化といったヒト細胞と共生菌との間で働くシグナルおよびその伝達機構の解明にも役立ち、天然物（環境因子）がシグナル分子として介する疾患の誘因および悪化のメカニズムの解明へと繋がり、さらに予防へと貢献できるはずである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．コリバクチン産生菌に対する抗体IgMのエピトープ決定。これまでに得られたコリバクチン生産大腸菌#50に特異的なIgMモノクローナル抗体のエピトープを決定するため、ウエスタンブロッティングによりモノクローナル抗体が検出する抗原を可視化した。バンドパターンによりO抗原がエピトープと推定された。そこで、O抗原が存在するLPSおよびPSを抽出し、競合ELISA実施した。結果、モノクローナル抗体のエピトープはO抗原であることを明らかにした。
２．コリバクチン生産性とO抗原との関係の確認。コリバクチン生産大腸菌#50に特異的なモノクローナル抗体のエピトープと推定されたO抗原とコリバクチン生産性との関係を確認するのため、大腸菌41菌株についてO血清群の判定を行った。さらにデータベースにあるヒトに関連する大腸菌について、コリバクチン生産関連遺伝子clb遺伝子クラスターとO抗原遺伝子との関係を調査した結果、ヒトに関連するO6抗原を持つ大腸菌のclbB遺伝子クラスター保有率は高く、コリバクチン生産菌の検出にO６抗原を用いることが有効であることが示唆された。
３. コリバクチン産生菌に対するIgG抗体の取得。コリバクチン産生菌に対する抗体を用いた組織の免疫染色、特異性の高いELISA等の応用に供するため、これまで得られたIgM抗体の情報をもとにIgG抗体を取得した。得られたIgG抗体のエピトープはO6抗原であり、CDR配列はIgM抗体S96-09と酷似していた。
4．ELISA法による便検体中のコリバクチン生産大腸菌の検出。得られたコリバクチン生産大腸菌に対するIgG、IgM抗体を用いて、ELISA法による便検体中のコリバクチン生産菌の検出を検討した。ELISA法による便検体中のO6抗原を持つコリバクチン生産大腸菌を検出することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
コリバクチン生産大腸菌の感染を検出するための血液中の抗体を標的としたELISA法をデザインしたが、大腸菌そのものを対象とした場合、コリバクチン生産菌と非生産菌の差異を検出することは難しかった。これは、生産性に関係なく共通に認識される抗体よるものであると考えられる。そこでコリバクチン生産菌と非生産菌を特異的に区別することができるO抗原を対象とすることで、特異的な検出が可能となると考えられる。ELISA法での固相化をLPSに限定する本方法によって実際に検出されるのは、血液中の抗O抗原抗体となる。＃50が持つO6抗原が存在するLPSを採用した場合、すべてのコリバクチン生産大腸菌がO6抗原を持つわけではない、コリバクチン非生産菌がO6抗原を持つ可能性は否定できないなど、考慮すべき問題は存在する。しかし、O6抗原だけではなく、コリバクチン生産菌と関連付けられるO18抗原、O4抗原などを持つLPSを同時に固相化することにより、より多くのコリバクチン生産菌が対象となりえる。本方法の確立は感染リスク評価検査の可能性として、重要な第一歩といえるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
コリバクチ産生菌感染ルート確定
沖縄県の中部、南部、北部、八重山・宮古医療圏内にある25の認可保育所に在籍する3-5歳児と母親とのペアを250組（500人）集めることを予定している。必要に応じ父子ペアも集める予定である。このコホートから得られるペア糞便試料を解析する。
コリバクチン産生菌が得られた場合、クローンの全ゲノム解析をすることでコリバクチン生合成遺伝子を有するコリバクチン産生菌であることを決定する。これらの解析を詳細に行うことで感染ルートを確定する。
オミックスデータを用いたコリバクチン産生菌陽性ヒト大腸がんの分子プロファイリング
我々はこれまでの10年間で、がん種横断的な約12,000症例の患者の腫瘍組織、その周辺組織、及び血液に対して、全エクソーム及び網羅的遺伝子発現解析を行ってきた。その前半の6,000症例については、臨床情報が完全突合された状態にあり、大腸がんでは約2,000症例のデータが存在する。また、全ゲノム解析や全トランスクリプトームデータも取得しつつある。はじめに、大腸菌が産生するコリバクチンと日本人における大腸発がんとの関係を明らかにするため、これらのオミックスデータの中から、大腸がん症例のゲノムデータを用いて、コリバクチン産生菌のゲノム、及びコリバクチン感染に特異的な変異シグネチャー（SBS88及び ID18）を解析し、既存の欧米のヒト大腸がんのデータと比較する。次に、腫瘍組織を用いたコリバクチン産生菌に対するPCRを行い、その検出結果とゲノムデータの相関性を求める。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment
A: 順調に研究が進展しており、期待どおりの成果が見込まれる
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