Formation of biological barriers by diverse ceramides

• Project/Area Number: 22H04986
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Broad Section H
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 木原 章雄 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (50333620)
• Project Period (FY): 2022-04-27 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥192,920,000 (Direct Cost: ¥148,400,000、Indirect Cost: ¥44,520,000); Fiscal Year 2025: ¥38,350,000 (Direct Cost: ¥29,500,000、Indirect Cost: ¥8,850,000); Fiscal Year 2024: ¥38,090,000 (Direct Cost: ¥29,300,000、Indirect Cost: ¥8,790,000); Fiscal Year 2023: ¥37,570,000 (Direct Cost: ¥28,900,000、Indirect Cost: ¥8,670,000); Fiscal Year 2022: ¥40,690,000 (Direct Cost: ¥31,300,000、Indirect Cost: ¥9,390,000)
• Keywords: セラミド / 脂質 / バリア形成 / スフィンゴ脂質 / 質量分析

Outline of Research at the Start

脂質は疎水性と絶縁性に優れ，体表面における透過性バリアと神経インパルスの絶縁体としての機能をもつ。前者の異常は感染症，アトピー性皮膚炎，魚鱗癬などの皮膚疾患，後者の異常は運動機能障害などの神経疾患を引き起こす。脂質の中でもセラミドおよびセラミド含有脂質はこれらのバリア機能に重要な役割を果たす。本研究ではバリア形成に関連したセラミドの分析技術の開発，生理的役割，代謝，病態の分子機構の解明を行う。

Outline of Annual Research Achievements

SPTLC3がノックアウト（KO）したヒト不死化ケラチノサイトとマウスを作成した。SPTLC3 KOヒトケラチノサイトでは，C16，C17，C21-C24の鎖長の長鎖塩基をもつセラミドの量が減少した。また，マウスの表皮の長鎖塩基の鎖長が主にC16，C17，C18であることを明らかにした。
エポキシエノン型アシルセラミドのマイケル反応付加体がマウス表皮の少なくとも結合型セラミド全体の6割を占めることを明らかにした。アシルセラミドと結合型セラミドの産生に関わるElovl1，Elovl4，Cers3，Cyp4f39，Pnpla1，Sdr9c7はマウス頬粘膜，舌，食道，胃で発現していた。アシルセラミド産生に関与する3つの遺伝子（Elovl1，Cyp4f39，Fatp4）それぞれのKOマウスの皮膚バリア異常の程度とセラミド組成の違いを明らかにした。魚鱗癬症候群の１つであるIFAP症候群の患者角質層ではフィトセラミドNPの減少と2-水酸化脂肪酸含有セラミドASの増加などアトピー性皮膚炎患者でのセラミド組成変化と似た変化が観察された。
シェーグレン・ラルソン症候群モデル細胞中でヘキサデセナール産生に関わるSGPL1を欠損させたところ，アシルセラミド量が正常化した。このことからこの疾患の発症にヘキサデセナールが関わることが示唆された。
アルファ酸化に関わるHacl2のKOマウスの脳と胃では奇数鎖ヘキソシルセラミドとセラミドがそれぞれ減少した。このマウスの脳の形態は正常であった。アルファ酸化がほぼ完全に停止したHacl1 Hacl2二重KOマウスは行動実験の１つであるワイヤーハングにおいて表現型を示した。Fads3 KOマウスの脳の形態観察と行動実験では異常は見られなかった。セラミド中に多い極長鎖脂肪酸について，その産生に関わるトランス-2-エノイルCoA還元酵素の活性制御とTyr残基を介した反応機構を解明した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本年度予定していた交付申請書に記載した内容はほぼ全て予定通り行った。これらの解析によって，研究計画書に記載の7項目のうち，既に完了した1項目を除く下記6項目に関して順調に進展した。1. 表皮における結合型セラミドの分子実体の解明，2. 臨床検体を用いた角質層セラミドのプロファイリング，3. アシルセラミドの口腔バリア機能，4. セラミド代謝不全とシェーグレン・ラルソン症候群，5. アルファ-水酸化セラミド代謝とミエリン機能，6. スフィンガジエン型セラミドと神経機能。
交付申請書に記載した内容以上に下記の「多様なセラミドを生み出す分子機構と病態の解明」と「アシルセラミド関連遺伝子変異による皮膚バリア異常の解明」に関する項目が進捗した。1. 極長鎖脂肪酸産生に関わるトランス-2-エノイルCoA還元酵素の活性制御と反応機構の解明，2. アシルセラミド産生の異なるステップに関与する3つの遺伝子（Elovl1，Cyp4f39，Fatp4）のKOマウスの皮膚バリア異常とセラミド組成の関係，3. 常染色体潜性先天性魚鱗癬を引き起こすPNPLA1の変異体（16種）の酵素活性の低下とABHD5との相互作用変化の解明。以上のことから「当初の計画以上に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

セラミドの長鎖塩基多様性を生み出す分子機構に関して，長鎖塩基鎖長をヒト化させたマウスを創出して解析する。具体的にはヒト表皮で発現しているがマウス表皮で発現していないSPTSSBをマウス表皮で発現させたトランスジェニックマウスを作成する。また，奇数鎖の長鎖塩基をもつセラミドの産生がアルファ酸化によって生み出されるのかをHacl1 Hacl2二重KOマウスの表皮セラミド組成を測定することで明らかにする。
結合型セラミドに関してこれまでに明らかにしたマウスでの構造がヒトにおいても同様であるのかを確認すると共に，結合型セラミドのターゲットタンパク質を同定する。
臨床検体を用いた角質層セラミドのプロファイリングに関しては順次共同研究先から提供される魚鱗癬患者サンプルを解析する。シェーグレン・ラルソン症候群の発症の分子機構として，セラミド分解物であるヘキサデセナールの蓄積がセラミド関連酵素を攻撃して活性を低下させているという我々のモデルをin vivoで検証していく。また，表皮においてどのくらいセラミド分解が活発に起こっているのかを，酸性セラミダーゼASAH1 KOケラチノサイトを作成し，セラミド量を調べることで明らかにする。
アルファ水酸化セラミド代謝とミエリン機能に関しては，アルファ酸化がほぼ完全に停止したHacl1 Hacl2 二重KOマウスを詳細に解析することによって解明する。さらに，ミエリンを構成する脂質の役割を総合的に理解するためにミエリンに特徴的に多いエタノールアミンプラズマロージェンの産生が不全となったモデルマウス（Far1 KOマウス）を作成して解析していく。スフィンガジエン型セラミドの生理機能に関しては，脳だけでなく，スフィンガジエン型セラミドが多い腎臓でのFads3 KOマウスの表現型も解析していく。

Assessment Rating

Interim Assessment Comments (Rating)

A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of California San Diego(米国)
• [Int'l Joint Research] Demiroglu Bilim University(トルコ)
• [Journal Article] Comparison of skin barrier abnormalities and epidermal ceramide profiles among three ω-O-acylceramide synthesis-deficient mouse strains (2024)
  • Author(s): Yamamoto Yuta, Sassa Takayuki, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 113 Issue: 1 Pages: 10-17
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2023.12.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Catalytic mechanism of trans-2-enoyl-CoA reductases in the fatty acid elongation cycle and its cooperative action with fatty acid elongases (2024)
  • Author(s): Kato Ryoya, Takenaka Yuka, Ohno Yusuke, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 300 Issue: 2 Pages: 105656-105656
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2024.105656
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Involvement of ω-O-acylceramides and protein-bound ceramides in oral permeability barrier formation (2023)
  • Author(s): Sassa Takayuki, Kihara Akio
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 42 Issue: 4 Pages: 112363-112363
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112363
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Determining the structure of protein-bound ceramides, essential lipids for skin barrier function (2023)
  • Author(s): Ohno Yusuke, Nakamura Tetsuya, Iwasaki Takafumi, Katsuyama Akira, Ichikawa Satoshi, Kihara Akio
  • Journal Title: iScience Volume: 26 Issue: 11 Pages: 108248-108248
  • DOI: 10.1016/j.isci.2023.108248
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Role of 2-hydroxy acyl-CoA lyase HACL2 in odd-chain fatty acid production via α-oxidation in vivo (2023)
  • Author(s): Mori Keisuke、Naganuma Tatsuro、Kihara Akio
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 34 Issue: 9
  • DOI: 10.1091/mbc.e23-02-0042
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Metabolism of sphingadiene and characterization of the sphingadiene-producing enzyme FADS3 (2023)
  • Author(s): Jojima Keisuke、Kihara Akio
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids Volume: 1868 Issue: 8 Pages: 159335-159335
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2023.159335
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 多様なセラミドによる皮膚の透過性バリア形成 (2023)
  • Author(s): 木原 章雄
  • Journal Title: Farumashia Volume: 59 Issue: 1 Pages: 34-38
  • DOI: 10.14894/faruawpsj.59.1_34
  • ISSN: 0014-8601, 2189-7026
• [Journal Article] スフィンゴ脂質の多様性とセラミドの皮膚バリア機能 (2023)
  • Author(s): 木原 章雄
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 41 Pages: 49-56
• [Journal Article] Incomplete elongation of ultra-long-chain polyunsaturated acyl-CoAs by the fatty acid elongase ELOVL4 in spinocerebellar ataxia type 34 (2023)
  • Author(s): Tamura Yuka, Sassa Takayuki, Nishizawa Takumi, Kihara Akio
  • Journal Title: Molecular and Cellular Biology Volume: 43 Issue: 2 Pages: 85-101
  • DOI: 10.1080/10985549.2023.2169563
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Bifunctional DEGS2 has higher hydroxylase activity toward substrates with very-long-chain fatty acids in the production of phytosphingosine-ceramides (2023)
  • Author(s): Ota Ai, Morita Hiroya, Naganuma Tatsuro, Miyamoto Masatoshi, Jojima Keisuke, Nojiri Koki, Matsuda Junko, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 10 Issue: 4 Pages: 104603-104603
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2023.104603
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An ERAD‐independent role for rhomboid pseudoprotease Dfm1 in mediating sphingolipid homeostasis (2022)
  • Author(s): Bhaduri Satarupa, Aguayo Analine, Ohno Yusuke, Proietto Marco, Jung Jasmine, Wang Isabel, Kandel Rachel, Singh Narinderbir, Ibrahim Ikran, Fulzele Amit, Bennett Eric J, Kihara Akio, Neal Sonya E
  • Journal Title: The EMBO Journal Volume: 42 Issue: 4
  • DOI: 10.15252/embj.2022112275
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ceramide Analysis in Combination With Genetic Testing May Provide a Precise Diagnosis for Self-Healing Collodion Babies (2022)
  • Author(s): Takeichi Takuya, Ohno Yusuke, Tanahashi Kana, Ito Yasutoshi, Shiraishi Ken, Utsunomiya Ryo, Yoshida Satoshi, Ikeda Kenta, Nomura Hayato, Morizane Shin, Sayama Koji, Ogi Tomoo, Muro Yoshinao, Kihara Akio, Akiyama Masashi
  • Journal Title: Journal of Lipid Research Volume: 63 Issue: 12 Pages: 100308-100308
  • DOI: 10.1016/j.jlr.2022.100308
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hypomyelinating spastic dyskinesia and ichthyosis caused by a homozygous splice site mutation leading to exon skipping in ELOVL1 (2022)
  • Author(s): Takahashi Taiko, Mercan Sevcan, Sassa Takayuki, Akcapinar Gunseli Bayram, Yararbas Kanay, Susgun Seda, Iseri Sibel Aylin Ugur, Kihara Akio, Akcakaya Nihan Hande
  • Journal Title: Brain and Development Volume: 44 Issue: 6 Pages: 391-400
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2022.03.003
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Whole picture of human stratum corneum ceramides, including the chain-length diversity of long-chain bases (2022)
  • Author(s): Suzuki Madoka, Ohno Yusuke, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Lipid Research Volume: 63 Issue: 7 Pages: 100235-100235
  • DOI: 10.1016/j.jlr.2022.100235
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impaired production of skin barrier lipid acylceramides and abnormal localization of PNPLA1 due to ichthyosis-causing mutations in PNPLA1 (2022)
  • Author(s): Nohara Tomohiro, Ohno Yusuke, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 107 Issue: 2 Pages: 89-94
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2022.07.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ceramide profiling of stratum corneum in Sjogren-Larsson syndrome (2022)
  • Author(s): Arai Ayami, Takeichi Takuya, Wakamoto Hiroyuki, Sassa Takayuki, Ito Yasutoshi, Murase Yuya, Ogi Tomoo, Akiyama Masashi, Kihara Akio
  • Journal Title: Journal of Dermatological Science Volume: 107 Issue: 3 Pages: 114-122
  • DOI: 10.1016/j.jdermsci.2022.08.003
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Skin permeability barrier formation by ceramides (2023)
  • Author(s): Kihara Akio
  • Organizer: The 11th Annual Congress of Pan Asian-Pacific Skin Barrier Research Society
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 先天性魚鱗癬IFAP症候群患者の角質層脂質組成解析 (2023)
  • Author(s): 水野佑香, 城島啓佑, 滝奉樹, 武市拓也, 秋山真志, 木原章雄
  • Organizer: 日本薬学会北海道支部150回例会
• [Presentation] 多様なセラミドによる皮膚透過性バリア形成 (2023)
  • Author(s): 木原章雄
  • Organizer: 第2回アトピー性皮膚炎とバリア機能について考える会
  • Invited
• [Presentation] セラミド不飽和化酵素FADS3の基質特異性とスフィンガジエンの代謝 (2023)
  • Author(s): 城島啓佑, 木原章雄
  • Organizer: 第65回日本脂質生化学会
• [Presentation] 表皮結合型セラミドの構造決定：マイケル付加反応により産生されるシステイン結合型セラミド (2023)
  • Author(s): 大野祐介, 中村哲也, 勝山彬, 市川聡, 木原章雄
  • Organizer: 第65回日本脂質生化学会
• [Presentation] ELOVL4ミスセンス変異による脊髄小脳失調症34型における超長鎖多価不飽和脂肪酸の不完全伸長 (2023)
  • Author(s): 田村優花, 佐々貴之, 西澤卓海, 木原章雄
  • Organizer: 第65回日本脂質生化学会
• [Presentation] Formation of skin permeability barrier by diverse ceramides (2023)
  • Author(s): Kihara Akio
  • Organizer: 29th annual meeting of Korean Society of Skin Barrier Research
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular mechanism of permeability barrier formation by ceramides (2023)
  • Author(s): Kihara Akio
  • Organizer: 2023 International BioLipids Interactomics Research Center annual symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] SREBF1変異を有する先天性魚鱗癬IFAP症候群患者の角質層脂質組成解析 (2023)
  • Author(s): 水野佑香, 城島啓佑, 滝奉樹, 武市拓也, 秋山真志, 木原章雄
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 神経系における長鎖脂肪族アルコール産生酵素FAR1の機能 (2023)
  • Author(s): 髙橋典雅, 大塚賢人, 佐々貴之, 木原章雄
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 角質層の遊離セラミド組成と皮膚の乾燥・外観指標との相関解析 (2023)
  • Author(s): 高橋夏海, 秋山史成, 上田悠人, 多田静乃, 竹内伸之, 大野祐介, 木原章雄
  • Organizer: 第16回セラミド研究会学術集会，第17回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] 口腔バリア形成へのセラミドの関与 (2023)
  • Author(s): 佐々貴之, 木原章雄
  • Organizer: 第16回セラミド研究会学術集会，第17回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] 皮膚バリア形成に重要な結合型セラミドの構造決定 (2023)
  • Author(s): 大野祐介, 中村哲也, 岩崎貴文, 勝山彬, 市川聡, 木原章雄
  • Organizer: 第16回セラミド研究会学術集会，第17回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] LIPN変異による魚鱗癬発症メカニズムの解明 (2022)
  • Author(s): 白井綜, 城島啓佑, 大野祐介, 木原章雄
  • Organizer: 日本薬学会北海道支部149回例会
• [Presentation] 表皮におけるフィトセラミドの産生機構とDEGS2の基質特異性の解明 (2022)
  • Author(s): 森田洋哉, 太田愛, 野尻光希, 城島啓佑, 木原章雄
  • Organizer: 日本薬学会北海道支部149回例会
• [Presentation] LC-MS/MSを用いたターゲットリピドミクスによるヒト角質層セラミド分子種の包括的解析 (2022)
  • Author(s): 大野祐介, 鈴木まどか, 川名桃子, 木原章雄
  • Organizer: 第64回日本脂質生化学会
• [Presentation] 脂肪酸伸長酵素ELOVLにより産生される極長鎖脂肪酸の多様な機能 (2022)
  • Author(s): 佐々貴之, 木原章雄
  • Organizer: 第43回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 2-水酸化スフィンゴ脂質から奇数鎖スフィンゴ脂質を生み出すα酸化の分子機構 (2022)
  • Author(s): 毛利圭佑, 永沼達郎, 木原章雄
  • Organizer: 第15回セラミド研究会学術集会，第16回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] 表皮フィトセラミド産生におけるDEGS2の寄与と水酸化・不飽和化の二機能活性における基質特異性の違い (2022)
  • Author(s): 森田洋哉, 太田愛, 宮本政宗, 城島啓佑, 野尻光希, 永沼達郎, 松田純子, 木原章雄
  • Organizer: 第15回セラミド研究会学術集会，第16回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] セラミド不飽和化酵素FADS3の基質特異性と4,14-スフィンガジエンの代謝 (2022)
  • Author(s): 城島啓佑, 木原章雄
  • Organizer: 第15回セラミド研究会学術集会，第16回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] ヒト三次元培養表皮を用いた結合型セラミド組成解析と肌機能評価への活用 (2022)
  • Author(s): 秋山史成, 井野口友紀, 大塚彩加, 竹内伸之, 大野祐介, 木原章雄, 高岡彰子
  • Organizer: 第15回セラミド研究会学術集会，第16回スフィンゴテラピィ研究会合同年会
• [Presentation] 魚鱗癬原因遺伝子Nipal4欠損マウス表皮におけるセラミド組成解析 (2022)
  • Author(s): 山地まりの, 大野祐介, 木原章雄
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Presentation] 皮膚バリアの維持におけるアシルセラミド及び結合型セラミドの役割 (2022)
  • Author(s): 平沼大雅, 佐々貴之, 木原章雄
  • Organizer: 日本薬学会第143年会
• [Remarks] 北海道大学薬学研究院生化学研究室
  • URL: https://www.pharm.hokudai.ac.jp/seika/index.php
• [Remarks] セラミド研究会
  • URL: https://www.ceramide.gr.jp
• [Remarks] 口腔バリア形成におけるセラミドの重要性を解明（プレスリリース）
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/2023/04/post-1212.html
• [Remarks] 皮膚バリア脂質である結合型セラミドの構造を解明（プレスリリース）
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/2023/11/post-1347.html
• [Remarks] 北海道大学薬学研究院生化学研究室
  • URL: https://www.pharm.hokudai.ac.jp/seika/index.html
• [Remarks] ヒト角質層セラミド分子種の全容の解明に関するプレスリリース
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/2022/06/post-1056.html