Study on Contribution of Protein and Tannin to Tryptophan-like Component in Excitation-Emission Matrix Fluorescence Spectroscopy

Research Project

Project/Area Number	22K04388
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 22060:Environmental systems for civil engineering-related
Research Institution	Center for Environmental Science in Saitama
Principal Investigator	池田和弘埼玉県環境科学国際センター, 水環境担当, 主任研究員 (60422987)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	日下部武敏京都大学, 工学研究科, 助教 (40462585)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords	三次元励起蛍光スペクトル / トリプトファン様ピーク / タンパク質 / タンニン / 指標 / アミノ酸 / 三次元励起蛍光スペクトル法 / 河川
Outline of Research at the Start	三次元励起蛍光スペクトル法による水質評価ではトリプトファン様ピークがタンパク質の量の指標としてよく利用される。一方、植物由来の有機物であるタンニンが多く共存する場合、ピーク位置がトリプトファン様ピークと重なるため、指標性に疑義が生じる。本研究は、河川水、湖沼水、下水において、トリプトファン様ピークが真にタンパク質の指標となるか実態を解明する。特にタンニンの影響に注目し、その程度を確認する。またトリプトファン様ピークがタンパク質量の指標となる条件（水の種類、流域特性、降雨状況など）について整理する。
Outline of Annual Research Achievements	三次元励起蛍光スペクトル法による水質評価が常法となりつつあり、河川等の水質評価に実務的に使用されつつある。検出されるトリプトファン様ピークはタンパク質の量の指標となると信じられており、藻類あるいは生活排水の河川への混入の指標として使用されている。一方、天然有機物であるタンニンが共存する場合、ピーク位置がトリプトファン様ピークと重なるため、指標性に疑義が生じる。本研究では、トリプトファン様ピークが真にタンパク質の指標となるか、河川水や下水を対象に検証し、特にタンニンの影響について解明する。指標となる場合の条件や環境を整理する。初年度である令和４年度は、まず、河川水の蛍光分析を河川38地点で月１回実施し、トリプトファン様ピークの蛍光強度データを取得し、地域や月間変動特性を把握した。蛍光強度の平均値は0.28±0.33 RUであった。下水処理場の直下で水が滞留しやすい地点で最大値を確認した。この地点では蛍光強度は基本的にBODと連動していたが、BODと比較して異常に強度の高い月も確認された。同じくタンパク質の指標として使用されるチロシン様ピーク強度はBODとよく連動していることから、トリプトファン様ピークへのタンパク質以外の成分の寄与が強く疑われる例を確認できた。次に溶存タンパク質濃度を、酸加水分解後に測定した15種類のアミノ酸濃度の和（DTAA）を算出することで評価した。下水流入水の調査を２回実施し、DTAAは、29μMおよび18μMであった。その試料のトリプトファンピークの蛍光強度は6.8 RUおよび4.6 RUであり、タンパク質濃度と連動していた。一方、河川水中のDTAA濃度は低く、定量には濃縮が必要であったが、その場合、還元剤を添加し脱気しても酸分解の過程でいくつかのアミノ酸が消失することが分かった。次年度は膜濃縮でタンパク質を選択的に濃縮して定量を実施する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、トリプトファン様ピークが真にタンパク質の指標となるか、河川水や下水を対象に検証し、特にタンニンの影響について解明する。具体的な研究内容は、「１．河川水、湖沼水、下水においてトリプトファン様ピークとタンパク質濃度に相関があるか検証する。２．トリプトファン様ピークに対するタンニンの影響の程度を解明する。３．影響の程度を河川水質等により整理し、指標となる条件や環境を把握する。」ことである。これまでに河川水の蛍光分析を河川38地点で月１回実施し、トリプトファン様ピークの蛍光強度データを取得し、地域や月間変動特性を把握した。BODが比較的低く、チロシン様ピーク強度が小さいことからタンパク質濃度が比較的低いことが推察されるにも関わらず、トリプトファン様ピーク強度の高い事例が確認できた。また、その時の水質データを取得した。さらに下水流入水の溶存タンパク質濃度を、酸加水分解後のアミノ酸濃度の和（DTAA）を算出することで評価し、現在までの調査では下水流入水においては、トリプトファン様ピークは溶存タンパク質濃度の指標となるという結果を得た。一方、河川水の溶存タンパク質濃度の測定には濃縮が必要であり、当初想定した方法での定量は困難であったが、スパイク試験等により回収率の低くなる工程を同定した。検討の結果、来年度は前処理を兼ねた膜濃縮を実施し、アミノ酸を定量することに決定した。これまでのところ、河川のタンパク質濃度測定に課題はあるが、概ね研究計画に沿って順調に研究が進んでいる。トリプトファン様ピークが真にタンパク質の指標となるか検証するための、重要なデータを取得できた。
Strategy for Future Research Activity	２年目は下水と河川水の蛍光およびタンパク質分析を継続し、トリプトファン様ピーク強度とタンパク質濃度に相関があるか検証を続ける。河川水のタンパク質分析では、膜濃縮を実施し、妨害成分の影響を除外して定量を行う。また、タンニンの影響が強くでることが予想される雨天時河川調査を実施する。さらに、トリプトファン様ピークに対するタンニンの寄与の程度を解明する。まずタンニンの指標として総ポリフェノール濃度を測定し、タンニン由来の蛍光の寄与を推算する。タンパク質濃度とトリプトファン様ピーク強度の相関性の低い試料でタンニン濃度が高いことを確認する。相関性の低い試料については、UF膜で分子量分画を実施し、タンニンの存在の確認分析を行う。