| Project/Area Number |
22K04820
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27020:Chemical reaction and process system engineering-related
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| Research Institution | Nara National College of Technology |
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Principal Investigator |
林 啓太 奈良工業高等専門学校, 物質化学工学科, 准教授 (10710783)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 秀美 奈良工業高等専門学校, 物質化学工学科, 教授 (70198232)
島内 寿徳 岡山大学, 環境生命自然科学学域, 准教授 (10335383)
亀井 稔之 奈良工業高等専門学校, 物質化学工学科, 准教授 (70534452)
石井 治之 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (80565820)
岩崎 智之 愛媛大学, 学術支援センター, 講師 (50808847)
市川 創作 筑波大学, 生命環境系, 教授 (00292516)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | 自己集合体 / シリカ粒子 / 相分離 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究の目的は，ベシクルテンプレート法を用いたメッシュ状中空シリカ粒子の調製とリソソーム病への応用である．テンプレートにはDDAB/SDSベシクルを用いる．TEOS重合反応は塩基性条件下で進行する．負に帯電するヒドロキシイオンはDDAB相に集積しやすいため，重合反応はDDAB相で選択的に進行すると考えられる．これによりメッシュ状中空シリカ粒子の調製が可能であると考えられる．また，相の大きさを制御することで貫通細孔の大きさの制御が可能である．メッシュ状中空シリカ粒子にβ-Galを封入することで，タンパク質分解酵素によるβ-Galの分解を抑制しつつ，多糖の分解を促進することが可能となる．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はgiant unilamellar vesicle(GUV)をテンプレートとして調製したメッシュ状中空シリカ粒子へのβ-galactosidaseの内包を試みた．β-galactosidaseにSulfo-Cy3 NHS esterを結合することによって蛍光ラベル化したSulfo-Cy3-β-galactosidase水溶液を内水相として逆相蒸発法によってGUVを調製した．GUVは1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)，1,2-distearoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)，cholesterol(Chol)を用いて調製した．主にDOTAPがLd相を，DSPC，CholがLd相を形成する．また，これらの脂質に加えて蛍光プローブである1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) (NBD-DSPE)を用いた．このGUVにtetraethyl orthosilicate(TEOS)、アンモニア溶液を添加して一定時間インキュベートすることでシリカ粒子を調製した．調製したシリカ粒子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察したところ，Sulfo-Cy3-β-galactosidaseがシリカ粒子内に内包されている様子が観察された．しかしながら，このシリカ粒子をSEMにより観察した結果，シリカ粒子を観察することができなかった．この原因として，形成されているシリカ膜が非常に薄く，シリカ粒子を乾燥させることで球体構造が維持できないためであると考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度までは順調に研究が進展していたが，シリカ粒子の構造が想定以上に強度が低かったため、やや遅れる結果となった．共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた光褪色後蛍光回復法によってシリカ膜が形成されている可能性は非常に高い可能性が示唆されているが，乾燥させることによって形状を維持できないほどに膜厚が非常に薄い．実際に今後の研究，及び実用化を考えた場合，より安定したシリカ粒子を調製する必要がある．本年度においては調製するときのGUVとTEOSのインキュベート時間を変化させたり，添加するアンモニア溶液量を増加させるなど検討を行ったが，十分な膜厚を得ることができなかった．シリカ粒子調製時にエタノールを添加することでTEOS重合反応速度が促進されることが報告されており，次年度においてはエタノールを添加して検討を行う予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度はまず，エタノールを添加してTEOSの重合反応速度を促進し，SEMで観察可能なシリカ粒子の調製を試みる．十分な膜厚のシリカ粒子が調製できた場合，これまでと同様にSulfo-Cy3-β-galactosidase水溶液を内水相としてシリカ粒子を調製し，共焦点レーザー蛍光顕微鏡により観察することで，Sulfo-Cy3-β-galactosidaseがシリカ粒子内に十分に内包されているかを確認する．また，このシリカ粒子をカバーガラスに固定化し，マイクロチューブポンプシステムを用いてβ-galactosidaseの基質である fluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG)および5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-Galactopyranoside (C12-FDG)を添加する．シリカ粒子内における蛍光強度を測定することで，基質がシリカ膜を透過し，内包されたβ-galactosidaseが機能するか評価する．十分に蛍光が観察された場合，large unilamellar vesicle(LUV)をテンプレートとしてシリカ粒子を調製する．細胞への応用を考えた場合，エンドサイトーシスによって取り込まれるためにはシリカ粒子の粒子径を数百nm程度に調整する必要があり，LUVがテンプレートとして適している．
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