| Project/Area Number |
22K04849
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Okinawa National College of Technology |
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Principal Investigator |
伊東 昌章 沖縄工業高等専門学校, 生物資源工学科, 教授 (00395659)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 新規ペプチド合成システム / 昆虫抽出液 / バイオリアクター / ペプチド創薬研究 / 低分子タンパク質 / ペプチド |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、約 20-50 残基の高分子量のペプチドを対象とし、昆虫抽出液をバイオリアクターとして用いた新規合成システムを開発し、「ペプチド創薬研究に活用できる技術」にすることを目的とする。
具体的には、以下の目標を掲げて研究を進める。
１．昆虫無細胞系を用い抗菌ペプチド 2 種を合成し、合成産物のウエスタンブロット解析、タグ精製、抗菌活性測定等条件の最適化を行い、合成ペプチド評価系を構築する。
２．構築した評価系と分子量の異なるペプチド 5 種程度を用い、合成条件等を最適化することで、100 μg/ml 以上の効率で機能性を有するペプチドの合成を実現する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
感染症等の治療薬開発に向けてペプチド創薬研究が活発化している。しかし、研究に用いる高分子量のペプチド合成において、固相合成等化学的方法では迅速
化やスケールアップが難しく、組換え大腸菌ではジスルフィド結合が形成できない等の不具合があり、研究推進の障壁となっている。そのため、本研究では、
我々が発案・実用化した昆虫無細胞タンパク質合成系を基盤とし、昆虫抽出液をバイオリアクターとして用いた新規ペプチド合成システムを開発し、「ペプチド創薬研究に活用できる技術」に創りあげることを目的とする。
２年目となる２０２３年度では、抗菌性を有するhuman cathelicidin（LL-37）（37アミノ酸残基、約4.5kDa）と，その前駆体(170アミノ酸残基、約20kDa)、の合成実験を行った。C末端にStrep-tagⅡ配列を導入したLL-37、およびLL-37前駆体発現プラスミドを鋳型として、mRNA合成キットを用いてmRNAを合成した。合成したmRNAにカイコ後部絹糸腺抽出液、リアクションバッファを加えて、25℃、５時間、合成を行った。その後、Strep-tagII配列によるウェスタンブロット解析を行った。その結果、LL-37およびLL-37前駆体については想定される分子量、それぞれ4.5kda, 21kDa付近（本体＋スペーサー＋Strep tag Ⅱのため）、に特異的なバンドとして検出することができた．これにより、本年度の目標を達成することができた。最終年度である2024度は、構築した評価系と分子量の異なる低分子タンパク質およびペプチド５種程度を用い、合成条件等を最適化することで、100 μg/ml以上の効率で機能性を有するペプチドの合成を実現する。また、合成したペプチドの機能性についても評価していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２年目となる２０２３年度では、昨年度よりさらに分子量の小さい抗菌性を有するhuman cathelicidin（LL-37）（37アミノ酸残基、約4.5kDa）と，その前駆体(170アミノ酸残基、約20kDa)の合成実験を行った。それらの発現用プラスミドを用いて、カイコ無細胞系にて低分子タンパク質の合成を行った。次に、低分子用のゲル濃度でのトリシン-SDS-PAGE、PVDF 膜等をペプチドに適するように変更した上で、合成産物のウエスタンブロット解析の条件の検討を行い、合成低分子タンパク質の評価系を構築することができた。その結果、さまざまな合成条件の検討を行うことで、LL-37およびLL-37前駆体については想定される分子量、それぞれ4.5kda, 21kDa付近（本体＋スペーサー＋Strep tag Ⅱのため）に特異的なバンドとして検出することができた．以上の成果より、２年目の目標が達
成できたことより、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度と今年度にて構築した評価系と分子量の異なるペプチド 5 種程度を用い、低分子タンパク質およびペプチド合成に適する抽出液作製条件、翻訳促進配列の創造、mRNA合成条件、低分子タンパク質およびペプチド合成時における反応条件等を最適化することで、タンパク質合成量と同等レベルである100 μg/ml 以上の効率での機能性を有するペプチドの合成を実現する。特に、ペプチドの機能性発現には、ジスルフィド結合が重要な場合が多いため、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオンを最適量加えることにより、ジスルフィド結合形成可能なペプチド合成システムを開発する。以上を実施し、開発目標を達成することで、従来の高分子量ペプチドの合成方法を補完し、ペプチド創薬研究に活用でき得る新規ペプチド合成システムを構築する。さらに、高分子量のタンパク質の発現解析を行うことで、ペプチドから高分子量のタンパク質の効率的な合成が可能な合成システムの確立を目指す。
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