自動塩基変異導入機構とヒト人工染色体を用いたCHO細胞での迅速な抗体作製法の開発

• Project/Area Number: 22K04851
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
• Research Institution: Kazusa DNA Research Institute
• Principal Investigator: 長谷川 嘉則 公益財団法人かずさDNA研究所, ゲノム事業推進部, グループ長 (30387683)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 抗体ライブラリー / ヒト人工染色体 / 自動塩基変異導入システム / 抗体 / 自動塩基変異導入機構 / CHO細胞

Outline of Research at the Start

本研究の目的は、実際の抗体医薬の大量生産に最も多く使用されているCHO細胞において、迅速な高機能抗体取得方法を確立する事である。研究代表者は、かずさDNA研究所の特許技術である新規の部位特異的組換えシステムを利用することにより、CHO細胞において迅速に抗体ライブラリーのスクリーニングを行う系を完成させている。さらに本研究において、自動塩基変異導入システムを追加させることによって、スクリーニングした抗体について実際の抗体医薬として望まれるKDである10-9M以下まで高めることを目標とする。また、抗体遺伝子および自動塩基変異導入システムの挿入箇所にヒト人工染色体（HAC）ベクターを利用する。

Outline of Annual Research Achievements

短期間での高機能な抗体の取得は、タンパク質発現に関する各種遺伝子実験への利用はもとより抗体医薬を使用した治療目的にも求められている。研究代表者は、かずさDNA研究所の特許技術である新規の部位特異的組換えシステムを利用した１細胞へ１種類の遺伝子をしかも１コピーだけ効率的に挿入する方法を活用して、CHO細胞において迅速に抗体ライブラリーのスクリーニングを行う系を完成させている。本研究では、そのシステムへ自動塩基変異導入システムを追加することによって、スクリーニングした抗体について実際の抗体医薬として望まれるKDである10-9M以下まで高めることを目標とする。昨年度は、自動変異システムに使用する遺伝子とその発現制御配列を2種類作製後、一つ目のプラスミドをHACベクターに搭載した。一つ目のプラスミドを搭載したHACベクター保有CHO細胞について、FISHで確認したところ、HACベクターはホストの染色体から独立して存在していた。今年度は、二つ目のプラスミドをHACベクターへ搭載を行った。FISHで確認したところ、2個のプラスミド搭載HACベクターもホストの染色体から独立して存在していた。次に、PCRおよびシーケンスで確認したところ、2個のプラスミドともに全長が保持されていて。RT-PCRで遺伝子発現を確認したところ、狙い通りに、一つ目のプラスミドの遺伝子は発現していたが、二つ目のプラスミドの遺伝子の発現は抑えられていた。そこで、テトラサイクリンを添加したところ、二つ目のプラスミドからの遺伝子発現も確認された。HAC上に搭載した2個のプラスミドによる遺伝子誘導系が完成した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

トラブルもなく予定通りに進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

これまで計画通りに進んでいるので、tet誘導系により抗体遺伝子の配列に、自動塩基変異システムを発動して変異の導入を行う。抗体遺伝子の変異プールを作製後、スクリーニングを行い、結合活性の上昇した抗体遺伝子を取得する。抗体遺伝子取得後には、遺伝時増幅を行い、迅速な高機能抗体取得方法を確立する。