Dynamic higher-order conformational changes control the fluorescence lifetime of fluorescent proteins
| Project/Area Number |
22K05027
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 32010:Fundamental physical chemistry-related
|
|---|
| Research Institution | Toho University |
|---|
Principal Investigator |
細井 晴子 東邦大学, 理学部, 准教授 (00313396)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
|
|---|
| Keywords | 黄色蛍光タンパク質 / 緑色蛍光タンパク質 / 発光メカニズム / 蛍光寿命 / 会合 / 構造緩和 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 蛍光タンパク質 / 時間分解蛍光分光法 / 蛍光異方性 / 高次構造ダイナミクス |
|---|
| Outline of Research at the Start |
生きたまま細胞や個体の可視化（イメージング）を可能にする蛍光タンパク質は、生命科学研究に必須のツールである。様々な機能をもつ蛍光タンパク質が開発され利用されているが、その基礎となる発光メカニズムの理解は限定的である。本研究では、蛍光タンパク質の会合とピコ秒からナノ秒のタイムスケールで起こるダイナミックな高次構造変化が、蛍光寿命を変化させていることを実証する。ピコ秒時間分解蛍光異方性測定により、 最もイメージングに用いられる2種類の蛍光タンパク質eYFPとeGFPの発光メカニズム、ダイナミックな高次構造変化、および、発色団周辺の局所的な構造変化（水素結合ネットワーク）の相関を明らかにする。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、すべての蛍光タンパク質に共通する発光メカニズム解明を目指している。本研究では、黄色蛍光タンパク質eYFPでは145番アミノ酸一つが変化するだけで蛍光寿命が大きく変化するが、非常によく似た緑色蛍光タンパク質eGFP（アミノ酸の相同性98%）ではあまり変化しないことに注目する。この事実は、通常説明されるような発色団周辺の水素結合ネットワークなどの局所構造の違いだけでは説明できない。研究代表者は、蛍光タンパク質の会合とピコ秒、ナノ秒のタイムスケールで起こるダイナミックな高次構造変化が、蛍光寿命を変化させていると考えている。本課題では、ピコ秒時間分解蛍光異方性測定により、最もイメージングに用いられるeYFPとeGFPの発光メカニズム、ダイナミックな高次構造変化、 および、発色団周辺の局所的な構造変化の相関を明らかにする。すでに、eYFP野生型の発光メカニズムにおいて、会合が大きな影響を与えていることを明らかにしている。
これまでに、eYFP Y145変異体のピコ秒時間分解蛍光異方性測定が終了している。その結果、１４５番アミノ酸一つの違いで、異方性が大きく変化することが明らかになった。また、対応するA206K変異体についても測定を行った。A206K変異は、eYFPの会合を抑制する効果をもつ。すべてのA206K変異体の異方性の時間変化が典型的な蛍光タンパク質単量体の挙動を示したことから、eYFP Y145変異体の大きな変化は、会合に由来することが明らかになった。
また、eGFP野生型の異方性の時間変化は、典型的な蛍光タンパク質単量体の挙動に近いことが分かった。つまり、eGFP野生型では、あまり会合が起きていないことを意味する。eYFP野生型とeGFP野生型の寿命はいずれも長いが、その会合状態は異なることが明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
装置の改良により、時間分解異方性測定の効率化ができたことから、eYFP Y145変異体、および、eYFP A206K/Y145変異体の測定を終了することができた。また、その結果が大きく変化したことから、期待通り蛍光タンパク質の発光過程におけるダイナミックな高次構造変化が起きていることを確認することができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、eYFP Y145変異体の異方性の大きな変化の起源を明らかにするために、濃度依存性やpH依存性を調べる。また、プロトン化状態の違いにより発色団は2種類ある。これまで、蛍光を発するアニオン型に注目してきたが、蛍光を発しないニュートラル型の影響もあることが示唆される結果が得られている。そこで、ニュートラル型のダイナミクスも併せて検討する予定である。
さらに、eGFP Y145変異体についても同様の実験を行う。得られた結果から、eYFPとeGFPについて、会合状態の違い、高次構造とダイナミクスの違いが、どのように寿命を決定しているのかを明らかにする。
|
Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
