| Project/Area Number |
22K05045
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 32010:Fundamental physical chemistry-related
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
石田 豊和 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (70443166)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 酵素反応機構 / 基底状態不安定化 / QM/MM計算 / 自由エネルギー計算 / バイオマス分解酵素 / Glycoside hydrolase (GH) / キシラナーゼ（Xylanase） / 生体内化学反応理論 / Glycoside hydrolase(GH) / ab initio QM/MM計算 / 構造－機能相関 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究の目的は「基底状態での基質不安定化が酵素反応を加速する」という古くからの作業仮説に関して、大規模量子計算を基礎とした精密分子化学計算をもとに詳細に検証することで、実験から基質歪みの重要性が示唆される酵素に対して、その酵素反応における触媒効果を分子科学の視点から解明することにある。特にバイオマス分解酵素の一種であるキシラナーゼを典型例として、ヘミセルロース分解プロセスにおける基質歪みが触媒活性に及ぼす効果、そして酵素のタンパク質場が基質を歪ませる構造的および静電的な要因をアミノ酸残基レベルで詳細に同定し、グリコシド結合加水分解反応に対して最も妥当な酵素触媒機構を理論計算の視点から提示する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質設計が現実的な課題となりつつある現時点においても、酵素触媒原理の本質については依然として未解明の課題が存在する。酵素反応の基本原理として「酵素が基質の反応遷移状態を強く認識する」考えが良く知られた一方で、「基底状態での基質不安定化が酵素反応を加速する」という作業仮説に関しては、現在でもその分子論的な実態が未解明のままである。本研究の主目的は、基底状態不安定化仮説を検証するための具体的な酵素反応系を選択し、非経験的量子化学計算と経験的分子力場を融合した複合シミュレーション手法（QM/MM計算）を用いて、酵素活性の分子論的起源を理論計算化学の視点から解明することにある。
対象となる酵素として、典型的なバイオマス分解酵素であるキシラナーゼ（Xylanase）を選択して、中性子構造解析により生理条件下でプロトン化状態が完全に決定された実験構造、および高分解能X線構造を組み合わせて、現時点で最も妥当性のある酵素基質複合体構造を構築することで、触媒反応の本質であるβグリコシド結合加水分解過程における基質不安定化（基質歪み）とタンパク質構造／エネルギー変化との相関を詳細に解析する。
基底状態不安定化仮説を検証するために２つのアプローチで計算を実行し、まずは典型的なQM/MM計算により反応自由エネルギー変化を追跡することで、基本的な反応メカニズムの解明を試みる。また並行して、反応環境への寛容性が酵素活性に及ぼす影響を通して酵素タンパク質の特異性を調べるため、反応温度および局所的なpH環境を変化させた場合の酵素反応過程の自由エネルギー計算を実施することで、タンパク質と基質の相互作用を複数の視点から解析して、活性中心近傍の局所的な構造変化が酵素活性に及ぼす影響を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
基底状態不安定化仮説を計算化学研究に基づいて検証するために、２つのアプローチにより研究を実施している。
既に報告した通り、QM/MM-MP2 レベルの構造最適化により、グリコシル化反応過程のポテンシャル面を定義し、反応経路上での酵素－基質複合体の構造を決定し、また反応経路に沿った代表的な最適化構造に対して、可能な実験構造との比較を行った。計算結果と実験構造解析と直接比較できる構造パラメータは非常に限定的で、安定点での活性中心近傍での水素結合ネットワーク等が代表的なものであるが、この点では計算結果は各種高分解能構造と非常に良い整合性を示している。
反応環境の寛容性を調べるために、反応温度を変化させた酵素反応系での反応自由エネルギー計算を進めているが、現時点で低温側（273K）から高温側（373K）の100度の温度幅において、10度刻みで反応温度を変化させた場合の自由エネルギープロファイルの計算が完了している。更に、局所的なpH環境の依存性を確認するために、酵素内に存在する３つのヒスチジン残基の荷電状態に注目し、過去の文献に基づき、溶液pHを変化させた環境下での反応自由エネルギー変化の計算も既に完了している。基準とした天然型の酵素反応系（環境温度 303K, pH=7）での自由エネルギープロファイルを参照として、各反応条件下での活性低下要因を調べているが、現時点では詳細なデータ解析が実行できておらず、上記評価とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
基底状態不安定化仮説への直接の検証として、QM/MM計算に基づく構造ベースでの基質歪みの検証に関しては、既に得られているQM/MM-MP2構造と、更にQM領域を大きく選択した大規模な電子状態計算計算との比較を通して、基質結合サイト近傍の詳細な構造解析を進めている。
構造ベースの計算解析手法の検討の一つとして、QM/MM構造を初期値としてフラグメント分子軌道法ベースの構造最適化／エネルギー成分解析も追加実施することで、QM/MM計算と全系量子計算との比較を通した蛋白質電子状態解析を試みる。
また局所的な環境変化が反応に及ぼす構造的要因を調べるためには、既に得られている自由エネルギー計算の詳細な成分解析が必要になり、特に今の計算モデルでは、蛋白質および溶媒和の寄与を明らかにすることが必須となる。この解析ツールは既に作成しデータ解析を実行中なので、反応活性変化と蛋白質構造の相関を抽出するための新たな解析手法を次年度に検討していく。この場合は特に、環境に依存した構造揺らぎが重要となるため、より長時間の自由エネルギー成分解析を実行し、得られた構造サンプルから構造変化の指標となりうる集団座標を抽出することで、基質歪みを誘導する可能性のある酵素の動的構造の検出を試みる。
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