| Project/Area Number |
22K05315
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University (2023)
Osaka University (2022) |
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Principal Investigator |
山田 剛史 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 特任講師 (80633263)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 環状RNA / アンチセンス / バックスプライシング / RNA / アンチセンスオリゴ / スプライシング / 核酸 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究課題は、バックスプライシングによって生合成されるノンコーディングRNAである「環状RNA」に着目し、その生合成を人為的に促進させるアンチセンスオリゴを開発する。本研究では、特に肝細胞がん・膀胱がんの増悪への影響が報告されている環状RNA「circZKSCAN1」に着目し、バックスプライシングの駆動力である相補的Alu配列の二重鎖形成を強化するASOによってその生合成を促進させる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、環状RNAの生合成機構であるバックスプライシングに着目し、新たに設計された合成オリゴヌクレオチド、CLIP-ONによって細胞内での環状RNA合成量を促進できるか調査した。バックスプライシングは、環状化するエキソンの上流と下流に位置するイントロンが相補鎖形成等によって架橋構造を形成し、上流のイントロンに存在するブランチポイントアデノシンと下流のイントロンの5’スプライシングサイトが近接することで促進される。CLIP-ONは、エクソンを挟む二つのイントロンと相補配列を有し、イントロン間の橋渡しを行うことでエキソンをまたいだヘアピン構造の形成を誘導し、環状RNA生合成を促進するトランス作用モデュレーターとして機能する。
HeLa細胞を使用したモデルpre-mRNAを用いて、CLIP-ONの投与によって標的の環状RNAが選択的に有意に増大することをRT-qPCRを用いて確認した。また、CLIP-ONの標的pre-mRNAとの結合をTm測定やITCを用いて確認し、環状RNA合成量がCLIP-ONのイントロン架橋能に依存していることが示された。
本研究は、細胞内の特定の環状RNAの表現を選択的に調節し、最終的には細胞機能を調節する新手法、CLIP-ONの設計と機能を初めて示した。しかしながら、本研究では特定の環状RNAおよび細胞モデルを対象としており、他の環状RNAや内在性環状RNAにおけるCLIP-ONの効果についてはさらに検討が必要である。CLIP-ONは、特定の環状RNAをターゲットとする新しい治療戦略の開発に貢献する可能性がある。また環状RNAの機能的研究や、疾患関連環状RNAの特定とその調節にも応用できる。本研究成果は研究期間中にScientific Reports誌にオープンアクセスで発表し、現在PCT申請を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
前年度は、RNA結合性低分子NCDを用いて環状RNA生合成促進のPOCをとり、査読論文を発表した。（Chem. Commun., 2022, 58, 3629-3632）本年度は、同様のコンセプトを異なるモダリティであるアンチセンスオリゴヌクレオチドで調査した。環状RNA(circZKSCAN1)を産生するモデルpre-mRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトしたHeLa細胞を使用し、環状化エキソンの上流と下流に隣接するイントロンを水素結合によって架橋するオリゴヌクレオチド（CLIP-ON）をデザインした。CLIP-ONの細胞への投与によるcircZKSCAN1合成量の有意な増大をRT-qPCRを用いて確認した。架橋構造の形成はnative-PAGE、Tm、ITCおよびSPR実験で確認した。活性を示したアンチセンスの解離定数は10 nM程度で、CLIP-ONの結合強度と相関があることも確認した。本研究成果は今年度英語査読論文で発表した。(Sci. Rep., 2024, 14, 8096.) 昨年度に申請した本研究の国内特許は、今年度に学内審査を通過しPCT特許申請に拡張した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究のコンセプトである「アンチセンスオリゴを用いて環状RNAの生合成を促進する」ことをモデル細胞で証明し、査読論文を発表することができた。次のステップは、本コンセプトの内在性環状RNAへの適用である。これまでの実験結果より、CLIP-ONによる環状RNA合成量の増大は標的とするpre-mRNAの高次構造の安定性に大きく依存することが、in silicoにおける高次構造予測によってわかっている。薬学的に意義の高い標的環状RNAを調査し、それらの環状RNAを生産するpre-mRNAに対するCLIP-ONの結合効果を、バイオインフォマティクスを用いて予測する手法を開発する。また、CLIP-ONの核酸化学修飾により結合能の強化・鎖長の短縮化・生体内安定性・毒性軽減を目指し、実用的なアプリケーションを目指す。
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