| Project/Area Number |
22K05338
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37020:Chemistry and chemical methodology of biomolecules-related
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
佐々木 要 東邦大学, 理学部, 准教授 (10611783)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | グリコシル化反応 / マンノシル化 / β-マンノシド / 立体選択性 / 異常配座糖 / アミノアシルpdCpA / チオカルボン酸 / 七炭糖 / 2,6-ラクトン / グリコシド / 糖鎖 / 収束的合成 / 固相合成 |
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| Outline of Research at the Start |
1,2-cis-エクアトリアルグリコシド（1,2-cis-β-グリコシド）結合を有する糖鎖の機械的あるいは収束的合成法を確立する．本申請課題が言う“機械的”合成とは，核酸やペプチドの固相合成のように，反応基質が決まれば有機合成化学者でなくとも，反応条件検討なしに任意の配列が合成できる手法である．また，“収束的”合成とは，一残基伸長ではなく，複数残基ずつ糖鎖伸長を行うブロック合成である．
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，タンパク質に結合した糖鎖や特有の単糖が生体内で果たす機能が注目されている．タンパク質や核酸は機械での自動合成が可能である一方で，糖や糖タンパクは構造が高度に複雑であることから，簡便な合成法の確立には至っておらず，構造と機能を結びつける研究の阻害要因となっている．そこで，①糖鎖部分を精密かつ機械的な合成，②糖鎖とタンパクの収束的な連結法，そして，③ある種に特有な単糖の合成を引き続き検討している．
②合成後の糖鎖を簡便かつ収束的にタンパクに導入する手法として，N-結合型糖タンパクの新規合成法の確立を目指し，（ⅰ）無細胞翻訳によってω-チオアスパラギン酸（sAsp）を表面に有するタンパク質を得たのち，（ⅱ）側鎖チオカルボン酸を足掛かりに合成の最終段階で糖鎖を導入し，収束的に糖タンパク質を合成する方法を立案した．今年度は，無細胞翻訳でチオアスパラギン酸を導入するために必要な非天然アミノ酸を有するtRNAの合成前駆体として，2’-位及び3’-位にチオアスパラギン酸を有する2’-デオキシシチジジル-2’,3’-O-ジアミノアシルアデノシン5’-リン酸（アミノアシルpdCpA）の合成を達成し，公刊論文で発表した．
③当研究室で独自に研究してきた2,6-ラクトン構造を活用したグラム陰性菌に特有な七炭糖の合成を行った．ヒトを含む脊椎動物とグラム陰性菌とでは細胞膜の成分と構造が異なり，ヒトの細胞膜は単層の脂質二重膜から構成されているのに対し，グラム陰性菌は内膜と外膜の二層の脂質二重膜から構成されており，外膜にはヒトが持たない七炭糖を有するリポ多糖（LPS）が存在する．その合成D-グリセロ-D-マンノ-ヘプトース-1β,7-ビスホスファート（β-HBP）の立体選択的合成を達成し，公刊論文で発表した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①糖とアルコールが連結する化学的グリコシル化反応は一般に，C-1位に脱離基を有する糖を求電子剤，アルコールを求核剤とする置換反応であり，立体制御が課題となる．なかでも，C-1位および2位がcis-配置のエクアトリアルグリコシド（β-マンノシド）の合成は特に困難であり，当研究室では，従来活用されてこなかった舟形配座糖供与体に着目し，2,6-ラクトン構造を有する求電子剤に用いた，β-マンノシド結合の高効率構築法の開発に取り組んでいる．昨年度までに，反応系内に存在する対アニオン，特にトリフラートイオンが，グリコシルカチオンと共有結合を形成し，メジャーなα-およびマイナーなβ-トリフラートを生成すること，また，それらのあいだに平衡が存在することを明らかにした．本年度は，望むβ-グリコシドの生成機構を明らかにするため，グリコシルトリフラートのC-1位に対する一次的速度論的同位体効果（KIE）の測定を行った．生成したトリフラートに求核力の小さい糖受容体を添加し，反応途中の2つの時点でKIEを算出したところ，一貫してSN1機構でのβ-グリコシドの生成が支持された．
②非天然アミノ酸であるω-チオアスパラギン酸を有するtRNAの供給の端緒として，市販のアデノシン，2’-デオキシシチジン及びBoc-Asp(OtBu)-OHを出発物質としてアミノアシルpdCpAの合成を達成した．
③容易に入手可能なD-マンノースから，グラム陰性菌外膜を構成するリポ多糖の生合成中間体であるβ-HBPの合成を検討した．合成上の課題となる7-位炭素の導入は， 2,6-ラクトン糖へのLiCH2Iの求核付加により達成し，6-位D-グリセロ配置は，6-オキソヘプトースの立体選択的還元により構築した．また，1-位β-リン酸化はα-グリコシルトリフラートの立体反転的求核置換により達成した．
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| Strategy for Future Research Activity |
糖鎖の精密合成手法の開発に向けて，当研究室で独自に研究してきた2,6-ラクトン法の反応機構の全容を明らかにする．これまでに，望むエクアトリアルグリコシドの生成がSN1機構であることを明らかにしてきた．それに加えて，望まないアキシアルグリコシドがSN2機構で生成することを明らかにするため，比較的求核力が大きく立体選択性が損なわれるモデル糖供与体を用いて，グリコシルトリフラートのC-1位に対する一次的速度論的同位体効果（KIE）の測定を行う．これにより，望まないアキシアルグリコシドがSN2機構で生成していることが明らかになれば，糖鎖合成においてもアルコールの求核力を下げることで立体選択的合成が可能になることを示せる． SN2反応で立体選択性を獲得する既往のグリコシル化反応は，合成する糖鎖が大きくなるにつれて求核力が低下し，合成最終盤で立体選択性が損なわれることになるが，2,6-ラクトン法では合成最終盤でこそ高い立体選択性が期待できる．ない求核力を強めることよりも，ある求核力を押さえることの方が難易度が低い．
さらに，これまでに合成法を確立してきたO-4位あるいはO-3位に2-ナフチルメチル基を有する2,6-ラクトン糖供与体などの基質と新規な活性化条件を用いて，実践的な糖鎖合成として，病原性グラム陰性菌Leptospira biflexaやCandida属等の抗原糖鎖抗原糖鎖の合成を行う．また，こちらも既に合成法が確立している，還元末端に2,6-ラクトンを有する多糖供与体4-O-（β-キシロシル）-マンヌロノ-2,6-ラクトンに対して新奇の活性化系を用い，グリコシル化と続く脱保護を繰り返すことで，抗凍結活性オリゴキシロマンナンを合成する．
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