インスリン分解酵素の活性分離に及ぼすチロシン修飾の影響
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22K05343
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37030:Chemical biology-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
幡川 祐資 東北大学, 薬学研究科, 助教 (30878351)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大江 知行 東北大学, 薬学研究科, 教授 (10203712)
李 宣和 東北大学, 薬学研究科, 准教授 (60519776)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | インスリン分解酵素 / チロシン残基 / Cookson型試薬 / タンパク質ラベル化 / 阻害剤 / アミロイドβ / インスリン |
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| Outline of Research at the Start |
インスリン分解酵素（IDE）は、インスリンのみならずアミロイドβ（Aβ）を分解する。
それ故、IDEは2型糖尿病（T2DM）のリスクを上げる反面、アルツハイマー病（AD）リスクを下げることから、IDEの基質特異性の調節（活性の分離）ができれば、T2DMの治療薬となり得る可能性が示唆される。IDEは活性及び基質結合部位の阻害により、基質特異性が変化し、活性部位周辺のチロシン (Tyr) 残基を変異させることで基質に対する分解活性を失う。本研究では、IDEのTyr残基の選択的ラベル化を行い、基質に対する分解活性を精査する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
インスリン分解酵素 (IDE) は、インスリン (Ins) のみならず、アミロイドβ (Aβ) も分解する。そのためIDEは、2型糖尿病のリスク上昇と、アルツハイマー病のリスク軽減の二面性を有する。一方IDEによる分解は、活性中心のactive siteと基質結合部位のexo siteが関与する。また、active siteとexo siteに2個のチロシン残基 (Tyr) が存在するため、これらの修飾を介し、Ins分解の抑制とAβ分解の亢進など、好ましい基質特異性の改変も期待される。そこでTyrとのEne反応が知られるCookson試薬 (4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione, PTAD) を用い、IDEのTyr修飾による基質特異性・分解活性への影響評価を目的とした。
PTAD修飾をしたIDE (PTAD-IDE) をtrypsin、V8およびchymotrypsinで処理し、LC-MS(/MS)により測定した結果、配列カバー率は89.97%であった。IDEに存在するTyr残基43個のうち15個の修飾が確認され、鍵となるactive siteとexo siteのTyrの修飾も同定された。またIDEが1日でAβとInsの両者を99%以上分解したのに対し、PTAD-IDEは3日でAβのみを99%以上分解し、Insの分解は見られなかった。更に、AβおよびInsが共存している試料内でも、同様の活性分離が確認された。ちなみにIDEのTyr314/Tyr831の複合体における基質との距離は、AβのGlu3/Phe19と各々10.6 Å/2.9 Å、InsのHis10/Phe1と各々2.8 Å/3.7 Åである事から、Tyr314/Tyr831両者からの結合距離の短いInsがより修飾の影響を受け、活性が阻害されたと推測した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
COVID-19感染拡大の影響による物品や試薬の欠品、納期の遅れなどにより研究計画が遅れている。特にインスリン分解酵素の発注 (海外から取り寄せ)は、納品まで1ヶ月以上の時間を要した。研究では、PTAD-IDEをLC-MS(/MS)で測定する際の前処理条件の設定に時間を費やした。理由としては、PTADを除くため固相抽出、分子量カットフィルター、ゲルろ過カラムを使用したが、IDEの吸着が問題となり結果には至らなかった。また、活性の分離を検討している際、AβやInsがLCやMSに詰まる事があり修理に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、PTADのよってIDEのAβおよびInsに対するキャラクタリゼーションは達成した。次にPTAD-IDEの活性度合いを蛍光基質(Substrate V)を用いて測定し、IDEとの差を比較する。また、IDEの基質には、AβとIns以外にブラジキニン、アミリン (ヒト膵島ぺプチドホルモン)やグルカゴンが存在するため、これらの基質に対して、PTAD-IDEがどのような分解活性を示すかを検討する。即ち、LC-MS(/MS)を用いて基質のフラグメントピークから切断点を精査し、特異性の変化を明らかにする。さらに、クライオ電子顕微鏡を用いてPTAD-IDEの立体構造を明らかにし、基質の分解活性のデータと照らし合わせる。クライオ電顕が測定できない場合、円二色性 (CD) 測定法、核磁気共鳴 (NMR) 分光法を用いて構造変化を観察する。
一方、現在保有している誘導体PTADのDMEQ-TADやNaphthalene-TAD(合成完了)だけではなく、その他の誘導体PTAD（-SO3H、NO2、ピレン等）を合成し、IDEと反応させ、基質特異性の変化を検討する。
その他、PTADをその他のメタロプロテアーゼと反応させ、酵素活性の変化を検討する予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
