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Development of rapid screening method to discover peptides capable of binding to target proteins using split intein

Research Project

Project/Area Number 22K05344
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 37030:Chemical biology-related
Research InstitutionGunma University

Principal Investigator

高橋 剛  群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90345380)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Keywordsインテイン / 標的結合ペプチド / ペプチドライブラリ / スクリーニング
Outline of Research at the Start

本研究では、申請者がこれまでに開発した、インテインを用いた細胞内でペプチド-タンパク質間の相互作用を検出できる方法を応用し、標的タンパク質に結合するペプチドの迅速探索法を確立することを目的とした。大腸菌の生存などを利用したスクリーニング系を構築し、直鎖状および環状ペプチドライブラリから、標的タンパク質に結合するペプチドを探索する。また、阻害剤の探索に適したスクリーニング系の構築も試みる。細胞内での相互作用をベースとした、標的結合ペプチドやPPI阻害剤の探索法の確立は、優れた中分子医薬を開発するための有用な方法となると期待する。

Outline of Annual Research Achievements

分割インテインは、2つのポリペプチド鎖をprotein trans-splicing (PTS) 反応で連結させる酵素様のタンパク質である。申請者は、分割インテインを用いた、リガンド-タタンパク質間相互作用検出系の開発を進めている。改変型分割インテインに、相互作用を調べたいペプチドとタンパク質を融合することで、ペプチド-タンパク質間の相互作用に依存してPTS反応が進行する系を構築した。反応の生成物として、カナマイシン耐性遺伝子産物であるaminoglycoside-3’-phosphotransferase 以下APH)を用いることで、ペプチド-タンパク質間の相互作用を大腸菌の生存を指標として検出できる。R4年度 は、この方法を用いて、がん関連タンパク質であるMDM2に結合するペプチドの探索を実施した。ペプチドライブラリをコードする遺伝子ライブラリを作製し、MDM2との結合スクリーニングを行った。ライブラリ中のMDM2結合ペプチドとMDM2が相互作用することで、活性型APHが生成し、カナマイシン含有培地中でも大腸菌が生存できると期待した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有寒天培地で培養し、得られたコロニーからペプチド配列を解析した。その結果、MDM2に強く 結合するペプチドを複数種類獲得することに成功した。また、得られたペプチドを化学合成し、MDM2との解離定数を算出した。R5年度は、得られたペプチドが実際に細胞内でMDM2に結合し、細胞のアポトーシスを誘導するかについての検討を行った。また、MDM2以外の標的タンパク質(Keap1およびSkp2)に対するペプチドの探索を実施した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

R4年度は、MDM2に結合するペプチドの探索を実施し、実際にMDM2結合ペプチドを複数得ることに成功した。また、結合親和性も十分に高いペプチドが得られた。また、R5年度は得られたMDM2結合ペプチドの機能評価や、MDM2以外の標的に対するペプチドの探索について実施した。以上から、研究はおおむね順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

R6年度は、MDM2を標的としたペプチドの探索について得られた結果をまとめ、論文として投稿する。また、MDM2以外のタンパク質として、昨年度から開始した、Keap1やSkp2に結合するペプチドの探索を引き続き行い、本手法の有用性を実証する。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (23 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (20 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results)

  • [Journal Article] Development of a β-lactamase activity assay for detecting ligand-protein interactions using an engineered split intein and β-lactamase2024

    • Author(s)
      H. Hagiwara, E. Fujii, T. Iwabuchi, T. Takahashi
    • Journal Title

      Bull. Chem. Soc. Jpn

      Volume: 97 Issue: 3

    • DOI

      10.1093/bulcsj/uoae019

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 反応性ペプチドタグおよびインテインタグを用いたペプチド-タンパク質間相互作用検出法の開発2023

    • Author(s)
      高橋剛
    • Journal Title

      月刊細胞

      Volume: 55 Pages: 73-77

    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Journal Article] Luminescence detection of peptide:<i>N</i>-glycanase activity using engineered split inteins2022

    • Author(s)
      Takahashi Tsuyoshi、Uchibayashi Tatsuya、Ishii Nozomi、Matsuo Ichiro、Yoshida Yukiko、Suzuki Tadashi
    • Journal Title

      Chemical Communications

      Volume: 58 Issue: 95 Pages: 13282-13285

    • DOI

      10.1039/d2cc04865e

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 改変型分割インテインを用いた特定のペプチド配列を認識するタンパク質の探索2024

    • Author(s)
      清水もも花、高橋剛
    • Organizer
      日本化学会第104春季年会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 超好熱菌由来システインレスインテインのタンパク質スプライシング活性の評価2024

    • Author(s)
      片桐栞太、高橋剛
    • Organizer
      日本化学会第104春季年会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 糖鎖認識F-boxタンパク質Fbs2と糖ペプチドとの相互作用解析2024

    • Author(s)
      相京碧、井上遥、高橋諭、石井希実、松尾一郎、吉田雪子、鈴木匡、高橋剛
    • Organizer
      日本化学会第104春季年会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 糖鎖認識F-boxタンパク質Fbs2と糖ペプチドとの相互作用解析2024

    • Author(s)
      信澤佳奈、高橋剛
    • Organizer
      日本化学会第104春季年会
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    • Author(s)
      T. Takahashi, N. Ishii, I. Matsuo, Y. Yoshida, T. Suzuki
    • Organizer
      13th International Peptide Symposium/15th Australian Peptide Conference
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Detection of peptide-MDM2 interactions and selection of MDM2-binding peptides using engineered split intein and kanamycin kinase2023

    • Author(s)
      Y. Watanabe, T. Takahashi
    • Organizer
      13th International Peptide Symposium/15th Australian Peptide Conference
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Design and synthesis of glycopeptides to examine the deglycosylating enzyme activities2023

    • Author(s)
      H. Inoue, S. Takahashi, N. Ishii, I. Matsuo, Y. Yoshida, T. Suzuki, T. Takahashi
    • Organizer
      13th International Peptide Symposium/15th Australian Peptide Conference
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      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Detection of peptide-Keap1 interaction and selection of Keap1-binding peptides using engineered split intein and kanamycin kinase2023

    • Author(s)
      K. Nobusawa, Y. Watanabe, T. Takahashi
    • Organizer
      13th International Peptide Symposium/15th Australian Peptide Conference
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      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of a selection method to discover peptides that bind to proteins using engineered split intein2023

    • Author(s)
      T. Takahashi, Y. Watanabe
    • Organizer
      第60回ペプチド討論会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Synthesis of glycopeptides and investigation of their reactivities toward deglycosylating enzymes2023

    • Author(s)
      H. Inoue, S. Takahashi, N. Ishii, I. Matsuo, Y. Yoshida, T. Suzuki, T. Takahashi
    • Organizer
      第60回ペプチド討論会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Selection of peptides that bind to Keap1 using intein-based selection method2023

    • Author(s)
      K. Nobusawa, Y. Watanabe, T. Takahashi
    • Organizer
      第60回ペプチド討論会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] トリマンノシルコア糖鎖をもつ糖ペプチドの合成と脱糖鎖酵素による反応性の検討2023

    • Author(s)
      井上遥、高橋諭、石井希実、松尾一郎、吉田雪子、鈴木匡、高橋剛
    • Organizer
      第17回東北糖鎖研究会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 細胞質ペプチド: N-グリカナーゼ活性の細胞内発光検出法の開発2023

    • Author(s)
      高橋剛、石井希実、松尾一郎、吉田雪子、鈴木匡
    • Organizer
      第17回東北糖鎖研究会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 分割インテインとカナマイシンキナーゼの再構成を利用したKeap1タンパク質に結合するペプチドの探索2023

    • Author(s)
      信澤佳奈、高橋剛
    • Organizer
      令和5年度 日本化学会関東支部 群馬地区研究発表交流会
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      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 分割インテインとカナマイシンキナーゼの再構成を利用した新規リガンド探索法の構築2023

    • Author(s)
      信澤 佳奈, 渡辺 雄太郎, 高橋 剛
    • Organizer
      日本化学会第103春季年会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 糖ペプチドの合成と細胞質ペプチド:N-グリカナーゼおよびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる反応性の検討2023

    • Author(s)
      井上遥, 高橋諭, 石井希実, 松尾一郎, 吉田雪子, 鈴木匡, 高橋剛
    • Organizer
      日本化学会第103春季年会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 分割インテインを用いた細胞質ペプチド:N-グリカナーゼ活性の細胞内発光検出2023

    • Author(s)
      高橋剛, 内林達也, 高橋諭, 石井希実, 松尾一郎, 吉田雪子, 鈴木匡
    • Organizer
      日本化学会第103春季年会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] Selection of peptides capable of binding to MDM2 using an engineered split intein2022

    • Author(s)
      渡辺雄太郎, 高橋剛
    • Organizer
      第59回ペプチド討論会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] Construction of a detection method for peptide: N-glycanase activity using engineered split inteins2022

    • Author(s)
      内林達也, 高橋諭, 石井希実, 松尾一郎, 吉田雪子, 鈴木匡, 高橋剛
    • Organizer
      第59回ペプチド討論会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 分割インテインを用いたペプチド:N-グリカナーゼ活性の発光検出2022

    • Author(s)
      高橋剛, 内林達也, 石井希実, 松尾一郎, 吉田雪子, 鈴木匡
    • Organizer
      第16回バイオ関連化学シンポジウム
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      2022 Research-status Report

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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