| Project/Area Number |
22K05344
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37030:Chemical biology-related
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
高橋 剛 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90345380)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | インテイン / 標的結合ペプチド / ペプチドライブラリ / スクリーニング |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、申請者がこれまでに開発した、インテインを用いた細胞内でペプチド－タンパク質間の相互作用を検出できる方法を応用し、標的タンパク質に結合するペプチドの迅速探索法を確立することを目的とした。大腸菌の生存などを利用したスクリーニング系を構築し、直鎖状および環状ペプチドライブラリから、標的タンパク質に結合するペプチドを探索する。また、阻害剤の探索に適したスクリーニング系の構築も試みる。細胞内での相互作用をベースとした、標的結合ペプチドやPPI阻害剤の探索法の確立は、優れた中分子医薬を開発するための有用な方法となると期待する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
分割インテインは、2つのポリペプチド鎖をprotein trans-splicing (PTS) 反応で連結させる酵素様のタンパク質である。申請者は、分割インテインを用いた、リガンド-タタンパク質間相互作用検出系の開発を進めている。改変型分割インテインに、相互作用を調べたいペプチドとタンパク質を融合することで、ペプチド-タンパク質間の相互作用に依存してPTS反応が進行する系を構築した。反応の生成物として、カナマイシン耐性遺伝子産物であるaminoglycoside-3’-phosphotransferase 以下APH)を用いることで、ペプチド-タンパク質間の相互作用を大腸菌の生存を指標として検出できる。R4年度 は、この方法を用いて、がん関連タンパク質であるMDM2に結合するペプチドの探索を実施した。ペプチドライブラリをコードする遺伝子ライブラリを作製し、MDM2との結合スクリーニングを行った。ライブラリ中のMDM2結合ペプチドとMDM2が相互作用することで、活性型APHが生成し、カナマイシン含有培地中でも大腸菌が生存できると期待した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有寒天培地で培養し、得られたコロニーからペプチド配列を解析した。その結果、MDM2に強く 結合するペプチドを複数種類獲得することに成功した。また、得られたペプチドを化学合成し、MDM2との解離定数を算出した。R5年度は、得られたペプチドが実際に細胞内でMDM2に結合し、細胞のアポトーシスを誘導するかについての検討を行った。また、MDM2以外の標的タンパク質（Keap1およびSkp2）に対するペプチドの探索を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R4年度は、MDM2に結合するペプチドの探索を実施し、実際にMDM2結合ペプチドを複数得ることに成功した。また、結合親和性も十分に高いペプチドが得られた。また、R5年度は得られたMDM2結合ペプチドの機能評価や、MDM2以外の標的に対するペプチドの探索について実施した。以上から、研究はおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
R6年度は、MDM2を標的としたペプチドの探索について得られた結果をまとめ、論文として投稿する。また、MDM2以外のタンパク質として、昨年度から開始した、Keap1やSkp2に結合するペプチドの探索を引き続き行い、本手法の有用性を実証する。
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