タンパク質化学合成を基盤としたエステル連結ユビキチンシグナル解析プローブの創製
| Project/Area Number |
22K05349
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 37030:Chemical biology-related
|
|---|
| Research Institution | Shizuoka University |
|---|
Principal Investigator |
佐藤 浩平 静岡大学, 工学部, 助教 (30756705)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
|
|---|
| Keywords | タンパク質化学合成 / ユビキチン / ペプチドヒドラジド / 水溶性タグ / エステル結合 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
タンパク質のユビキチン修飾は、高い構造多様性を分子基盤として多彩な生理機能を司っている。その中で、セリン／スレオニン側鎖ヒドロキシル基を介してエステル結合で連結したユビキチン鎖の機能解明は、研究ツールが不足しているため未踏領域となっている。分子動力学シミュレーションと化学合成法を組み合わせることで、エステル連結型ユビキチンの機能解明指向型タンパク質プローブの合理的設計と開発を実現する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質翻訳後修飾としてのユビキチン化は、プロテアソーム分解をはじめ広範な細胞内プロセスで重要な役割を担っている。ユビキチン同士が連結したポリユビキチン鎖形成により、極めて高い構造多様性を示すことがユビキチン修飾の多彩な細胞機能制御の分子基盤となっている。エステル結合で連結したポリユビキチン鎖は免疫関連のシグナル制御に関与するとの報告があるが、研究ツールの不足により詳細な機能解明研究は進んでいない。そこで、修飾位置の精密制御が可能な化学合成法を基盤としてエステル連結ポリユビキチン鎖機能解明プローブの開発を目的に研究を実施した。
まずユビキチンダイマー（Ub2）を合成標的として化学合成基盤の確立に取り組んだ。モデルとして63番目のリシンで連結したK63-Ub2を合成したところ、合成中間体の溶解性が問題になることが明らかとなった。すなわち、複数のペプチド鎖を化学選択的連結反応により連結する過程で、生成物の水系溶媒に対する溶解性が低くなりその後の反応・精製操作の取り扱いが煩雑になった。そこで、合成中のユビキチン鎖の溶解性向上を目指し、水溶性タグを利用する新規可溶化法を開発した。合成中間体ペプチドのC末端をヒドラジドとして、これを足掛かりにした還元的Nアルキル化反応によりポリリシン型水溶性タグを導入した。これにより、ペプチド鎖の溶解性が改善し反応・精製を容易に実施できるようになった。K63-Ub2骨格を構築後に水溶性タグを選択的に除去し、生じたヒドラジドからアシルアジドおよびチオエステルを経由してビオチン修飾ペプチドを連結することでビオチン化K63-Ub2の合成を達成した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はまず、ユビキチンダイマー（Ub2）を合成標的として化学合成基盤の確立に取り組んだ。モデルとして63番目のリシンで連結したK63-Ub2を合成したところ、合成中間体の溶解性が問題になることが明らかとなった。すなわち、複数のペプチド鎖を化学選択的連結反応により連結する過程で、生成物の水系溶媒に対する溶解性が低くなりその後の反応・精製操作の取り扱いが煩雑になった。そこで、合成中のユビキチン鎖の溶解性向上を目指し、水溶性タグを利用する新規可溶化法を開発した。
合成中間体ペプチドのC末端をヒドラジドとして、これを足掛かりにした還元的Nアルキル化反応によりポリリシン型水溶性タグを導入した。これにより、ペプチド鎖の溶解性が改善し反応・精製を容易に実施できるようになった。K63-Ub2骨格を構築後に水溶性タグを選択的に除去し、生じたヒドラジドからアシルアジドおよびチオエステルを経由してビオチン修飾ペプチドを連結することでビオチン化K63-Ub2の合成を達成した。
当初の予定では、エステル連結型ダイマーのモジュラー合成を今年度実施予定であったが、モデル合成を通じて溶解性の課題を洗い出すことができ新規ペプチド可溶化法の開発につながった。今回開発した可溶化法は、予定していたモジュラー合成に適用可能であることに加えて、分子プローブとして利用する際に重要なハンドルとなるビオチン修飾導入にも成功したことから、今後の誘導体合成が加速されると期待できる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
開発したペプチド可溶化法を最大限活用して、エステル連結ポリユビキチン鎖の化学合成を推進する。また、脱ユビキチン化エステラーゼの基質特異性評価に資するプローブとして蛍光タグ導入型誘導体の合成も進め、本プローブを利用した蛍光偏光解消法による酵素活性評価系を確立する。これにより、エステル連結位置の異なるユビキチン鎖に対する各種エステラーゼの基質特性プロファイルを解明するための基盤構築を目指す。
上記検討と並行して、非水解性ユビキチンアナログの設計基盤として分子動力学シミュレーションに基づく分子設計を推進する。
|
Report
(1 results)
Research Products
(10 results)
