| Project/Area Number |
22K05376
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
長南 茂 茨城大学, 農学部, 教授 (70312775)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 発酵 / 物質生産 / 応用微生物 / 生体分子 / コエンザイムA / 脂肪酸 / ポリヒドロキシ酪酸 |
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| Outline of Research at the Start |
コエンザイムA（CoA）は細胞内でアシル基のキャリアとして機能しており、全生物に共通して存在する補酵素である。申請者は大腸菌を用いてCoA生合成経路の強化は物質生産に有効であることを報告した。今回は、アセチル-CoA増産の有効性を生分解性プラスチック生産菌によるポリヒドロキシ酪酸（PHB）生産、マロニル-CoA増産の有効性は光合成細菌による脂肪酸生産および低温菌による高度不飽和脂肪酸生産にそれぞれ応用し、本要素技術の汎用性を実証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究では、細胞内でアシル基のキャリアとして機能しているコエンザイムA（CoA）の生合成経路を強化することにより、炭素代謝を活性化し、有用物質生産に応用できる技術開発を目的としている。令和5年度は、3種の外来パントテン酸キナーゼ（CoaA）を導入したCupriavidus necator H16でポリヒドロキシ酪酸（PHB）生産を、外来CoaAとアセチル-CoAカルボキシラーゼ（Acc）を組み合わせたマロニル-CoA増産技術はシアノバクテリアであるSynechococcus elongatus PCC 7942による脂肪酸生産でそれぞれ試験した。前者では、いずれの形質転換体でも培地1 LあたりのPHB生産量と菌体内PHB含量が上昇しており、外来coaA遺伝子導入によるアセチル-CoA増産の有効性が確認された。そこで、宿主のC. necator H16株のCoA生合成経路の調節機構を理解するために組換えCoaAの諸性質を解析したところ、最終生産物であるCoAやアシル-CoAで阻害を受けないことが明らかとなった。後者のシアノバクテリアによる脂肪酸生産では、菌体あたりの脂肪酸含量には違いが見られないが、培地1 Lあたりの脂肪酸生産量は外来遺伝子導入株の方が高い傾向を示した。チオエステラーゼである'TesAを用いた遊離脂肪酸生産では、coaA遺伝子とacc遺伝子を導入した大腸菌のマロニル-CoA増産株で生産量の増大がすでに確認されているが、薬剤排出ポンプ遺伝子の導入によって炭素鎖が14の脂肪酸を中心にさらに生産量を上昇させることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
3種の外来coaA遺伝子を導入したすべてのC. necator H16形質転換体でPHBの増産効果が観察された。宿主となるC. necator H16株のcoaA遺伝子をクローニングし、組換え酵素を解析して最終生産物阻害を受けないことを明らかした。外来のcoaA遺伝子とacc遺伝子を導入したS. elongatusによる脂肪酸生産では、通気培養と炭酸水素ナトリウムを添加した静置培養で脂肪酸生産を試験した。脂肪酸含量においてはマロニル-CoA増産株と対照株では違いが見られなかったが、脂肪酸生産量においては通気培養でマロニル-CoA増産技術が効果を示す傾向が見られた。大腸菌を用いたPUFA生産試験では、2種の低温菌から得られたPUFA合成遺伝子と宿主の組み合わせを検討した。その結果、PUFAの脂肪酸含量をおよそ3%にまで上げることに成功した。大腸菌による'TesAを用いた遊離脂肪酸生産への応用では、マロニル-CoA増産による効果が既に確認されているが、薬剤排出ポンプの導入で炭素鎖14の脂肪酸を中心にさらに生産量を上げることに成功した。しかし、低温菌によるPUFA生産ではcoaAおよびacc遺伝子を保持するマロニル-CoA増産用プラスミドの導入が鍵となるが、エレクトロポレーションによる形質転換法がまだ確立されていない。外来チオエステラーゼを使用した大腸菌による中鎖脂肪酸生産では、炭素鎖8から12の脂肪酸生成は確認されていない。
以上のように、低温菌よる高度不飽和脂肪酸への応用では遅れがみられるが、C. necatorによるPHB生産では大腸菌以外でのアセチル-CoA増産の有効性、大腸菌による遊離脂肪酸生産ではマロニル-CoA増産の有効性が確認されているため、研究計画全体から考えればおおむね順調に進んでいるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は本申請研究の最終年にあたる。C. necatorにおける外来coaAによるアセチル-CoA生合成経路の強化がPHB生産へに及ぼす影響、およびS. elongatusにおけるマロニル-CoA生合成経路の強化の脂肪酸生産への応用の2つを中心に進めることを計画している。PHB生産では、培地への窒素源添加量、すなわちPHB合成を担うポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の発現量も意識しながらアセチル-CoA増産効果を解析する。また、効果が見られたC. necatorのCoA生合成経路の調節機構を考察するため、鍵酵素となる組換えCoaAの酵素学的諸性質の解析をさらに進める。S. elongatusにおける脂肪酸生産では、令和5年度に検討した通気培養法を使ってマロニル-CoA生合成経路の強化の有用物質生産への有効性を詳しく検証する予定である。PUFA生産では大腸菌で令和5年度に検討した結果を基にして、CoaAおよびAccの併用効果を検証する予定である。
C. necator、S. elongatus、および大腸菌におけるCoA生合成経路の強化のPHB生産、あるいは脂肪酸生産への効果を精査し、CoAコファクターエンジニアリングの物質生産への有効性を総括する。
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