| Project/Area Number |
22K05384
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
益田 時光 九州大学, 農学研究院, 助教 (90778060)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本城 賢一 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00264101)
宮本 敬久 九州大学, 農学研究院, 学術研究員 (70190816)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | バクテリオファージ / ゲノム編集 / リーダレスバクテリオシン / レセプターバインディングプロテイン / 食中毒細菌 / リーダーレスバクテリオシン / CRISPR-Cas / leaderless bacteriocin / bacteriophage / tail fibers |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、食中毒細菌の制御を目的として、CRISPR -Casシステムに代表されるゲノム編集技術を用いたバクテリオファージ（以降ファージ）遺伝子改変技術の基盤の構築と改変ファージの応用を目指す。特に、ファージの宿主特異性を担うテイルファイバーについての改変や、宿主菌のゲノム中にファージゲノム情報が入り込んでしまう溶原化に関連する遺伝子を特定、取り除くことで安全性の高い溶菌ファージに変換することなどを目指す。また、宿主菌のファージ耐性化を防ぐための抗菌力強化のために、３）抗菌ペプチドリーダーレスバクテリオシン（LLB）産生ファージ（以降LLBファージ）の作製とその応用についての検討を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食中毒細菌の制御を目的として、CRISPR -Casシステムに代表されるゲノム編集技術を用いたバクテリオファージ（以降ファージ）遺伝子改変技術の基盤の構築と改変ファージの応用を目指し、以下の研究を行う。ゲノム編集によるファージ特性の改変として、１）複数テールファイバー（以降TF）遺伝子を保持するファージ（マルチテールファイバーファージ：以降MTFファージ）における宿主特異性とTF遺伝子の関連性の解明とその応用、２）溶原化関連遺伝子群や毒性遺伝子をゲノム編集によって取り除き、有用な溶菌ファージへと特性を改変させることを目指して研究を進めてきた。また、ファージ耐性化を防ぐための抗菌力強化のために、３）抗菌ペプチドリーダーレスバクテリオシン（LLB）産生ファージ（以降LLBファージ）の作製とその応用についての検討を進めてきた。
MTFファージについては、大腸菌ファージECP52ファージにおいて、その宿主認識機構についての詳細な知見が得られている。さらに別の大腸菌ファージであるPE37のTFをランダムに構造中に組み込むことで作製されたMTFファージ、ECP52-MTFの構築に成功し、実際に宿主域の拡大も達成された。また、グラム陽性細菌感染性のファージを用いて、MTFと類似したアプローチである、RBPシャッフリングファージの作製も行なっている．
すでに、（２）と（３）については当初の計画に沿った結果は出ており、現在はより効率的なゲノム編集技術の確立を目指し、CRISPR-Casシステムの構築をS. aureusなどのグラム陽性細菌でおこなっている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
MTFファージについては、当初予定していたゲノム編集による遺伝子導入という方法から変更し、遺伝子組み換えを含まない形のワンユースを想定した形の構築方法にシフトしたことで、大きく進展したと言える。つまり、宿主自身に外来TF遺伝子を発現させた状態でオリジナルのファージを感染させる形で、ファージの感染、増殖段階でTF構造がシャッフリングされた状態を可能にし、その結果宿主域の拡大に実際に成功した。これは、大腸菌ファージECP52において成功した。さらに、乳酸菌ファージやS. aureus感染性のファージにおいては、TFもその一種であるレセプターバインディングプロテイン（RBP）をシャッフリングしたファージの作製にも成功してきている．これらについては、本年度中により詳細なデータを追加し、論文投稿を目指す。
また、LLBファージ、溶原化関連遺伝子については、大腸菌ファージ、S. aureusファージにおいてすでに論文作製段階であり、本年度中に投稿する．
このように、計画していた３つのプロジェクトのうち、２つはほぼ論文化完了し、MTFファージについては、当初の予定以上に複数のファージにおいて宿主域拡大につながる可能性が見えているため、研究実施者の所感としては、計画以上に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である本年度は、MTFファージについてしっかりとした形にすることを１番の目標として研究を進めていく．具体的には、大腸菌ファージECP52を持ちいたMTFファージについて、遺伝子導入をした形のECP52-MTFについてもその作製を目指し、現在のMTFシャッフリング形式のMTFファージとの比較を行いたい。さらに、S. aureusなどのグラム陽性細菌ファージにおいてはRBPシャッフリングなどもおこなっていく．
LLBファージについては、当初予定していた大腸菌とS. aureus感染性ファージついては目標は達成されており、現在は、さらなる可能性を広げるために、リステリア菌についてもゲノム編集システムの構築段階から取り組んでいる．本研究期間中には完成できないかもしれないが、今後の本研究テーマの発展につながるものである．
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