Characterization of conductive nanowire from Geobacteraceae

Research Project

Project/Area Number	22K05385
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 38020:Applied microbiology-related
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	井上謙吾宮崎大学, 農学部, 准教授 (70581304)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000) Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords	細胞外電子伝達 / シトクロム / ナノワイヤー / 細胞外電子 / c型シトクロム / 生物電気化学 / Geobacter
Outline of Research at the Start	Geobacter sulfurreducensは、細胞外にある電極のような導体に電子を伝達することができるため、微生物燃料電池などの微生物電気化学分野で最も重要度の高い微生物種である。本株の電極への電子伝達には細胞外c型シトクロムOmcZが必須である。OmcZは「OmcZナノワイヤー」と呼ばれる電気伝導性ナノワイヤーを形成することが知られている。本研究では、OmcZナノワイヤーが電極と接触することができるのか、もしできるならば、どのような構造的特徴が電極との接触と電子伝達を可能にしているのかを明らかにし、OmcZナノワイヤーの大量生産系を構築する。
Outline of Annual Research Achievements	発電菌Geobacter sulfurreducensは細胞外への電子伝達に電気伝導性ナノワイヤーを利用することが知られている。本株が生産する電気伝導性ナノワイヤーには複数種存在することが報告されている（PilA、OmcS、OmcE、OmcZそれぞれを基本単位とする）。本研究は、電極への高効率な電子伝達に必須であるOmcZで構成されるナノワイヤー（OmcZナノワイヤー）について、電極への相互作用に必要な構造的特徴を明らかにすること、および、OmcZナノワイヤー形成に必須な因子を明らかにすることを目的とする。OmcZは翻訳後、OmcZLがプロテアーゼOzpAにより切断されてOmcZSとなることが知られており、OmcZナノワイヤーの構成単位はOmcZSである。前年度までにOmcZLを大量精製し、精製OmcZLをin vitroでOzpA処理することによってOmcZLを生成させた後、透過型顕微鏡観察を行うことで、OmcZSが自己組織化できるのかどうかを検証した。また、G. sulfurreducens菌体を用いて透過型電子顕微鏡でナノワイヤーが観察できる条件を検討した。OmcZLをOzpA処理したサンプルを電子顕微鏡で観察したところ、繊維状の構造物を確認することはできなかった。G. sulfurreducens菌体からOmcZナノワイヤーをエタノールアミンバッファーおよび限外ろ過フィルターを用いて精製を試みたところ、OmcZナノワイヤーだけでなく、特定の大きさのタンパク質がサンプル中に大量に含まれることが明らかになった。このタンパク質がOmcZナノワイヤーと高い親和性を持ち、相互作用（結合）している可能性があると考えられた。そのタンパク質については、ヘム染色により、c型シトクロムではないことが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 成熟前のOmcZL（Hisタグ付加）のみを発現するGeobacter sulfurreducensを作製し、OmcZLを大量に精製した。OmcZLをin vitroの系にて、OzpA（OmcZ protease A）による切断処理を行いOmcZSの生成させ、生成物を透過型電子顕微鏡で観察を行ったが、電気伝導性ナノワイヤーのような繊維状の構造物を確認することができなかった。また、界面活性剤抽出によって精製したOmcZSについて、界面活性剤除去剤によって分子表面の界面活性剤を除去したものについても同様に顕微鏡観察を行ったが、繊維状の構造物が確認されなかったことから、OmcZナノワイヤーの形成には、単純にOmcZLを切断することで生成したOmcZSのみでは自己組織化せず、正常なナノワイヤー形成には何らかの未知の因子が必要である可能性が示唆された。G. sulfurreducens菌体からOmcZナノワイヤーをエタノールアミンバッファーおよび限外ろ過フィルターを用いて精製を試みたところ、OmcZナノワイヤーだけでなく、特定の大きさのタンパク質がサンプル中に大量に含まれることが明らかになった。このタンパク質がOmcZナノワイヤーと高い親和性を持ち、相互作用（結合）している可能性があると考えられた。そのタンパク質については、ヘム染色により、c型シトクロムではないことが明らかになった。
Strategy for Future Research Activity	今回明らかになったOmcZの構造をともに、電極との距離が近いと思われる分子表面に近い位置にあるヘムc周辺のアミノ酸残基について、特に疎水性アミノ酸について置換体などの変異導入を行い、変異OmcZ発現株の電極への電子伝達能力について検証することで、電極との相互作用に必須なアミノ酸について明らかにする。OmcZナノワイヤー精製時、超構造として300 kDaの孔径の限外ろ過フィルターを用いている。つまり、十分な大きさのタンパク質でなければ精製サンプル内に混入しないはずであるが、精製OmcZナノワイヤーサンプルに特定の大きさのタンパク質が混入していた。このタンパク質の詳細を調べるため、まずはSDS-PAGEによる泳動後に当該タンパク質をゲルから切り出し、NanoLC/MSなどの手法によって当該タンパク質を特定する。その後、当該タンパク質の情報からOmcZナノワイヤーと相互作用し得るのかどうかをドッキングシミュレーションによる非生物学的な方法で予測するとともに、架橋タンパク質間相互作用解析などによる相互作用解析を行う。