| Project/Area Number |
22K05386
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
山城 哲 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00244335)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橘 信二郎 琉球大学, 農学部, 准教授 (70447655)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 紅麹 / コレラ菌 / コレラ毒素 / コレラ菌の運動 / 下痢症抑制 / 紅麹菌 / コレラの治療 / 逆行性細胞質内移動 |
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| Outline of Research at the Start |
紅麹菌発酵物をヘキサンで抽出した画分(MFE-H)でCHO細胞を前処理すると、その後のコレラ毒素（CTx）の添加によるCHO細胞の伸長・変形が有意に減じられた。これはMFE-HがCTxの生物活性を減殺することを示唆した。本研究では、1. MFE-Hに含まれるCTx生物活性を減殺する責任コンパウンドMFE-H(X)を同定すること、2. MFE-H(X)が示す機序を解明すること、3. MFE-H(X)によるCTx生物活性の減殺が、in vivoでも再現されるかを確認することを研究の目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
紅麹粗抽出物（MFRE）中に含まれる、下痢原性細菌と動物細胞の双方に作用して下痢症を抑制する可能性がある有効成分を絞り込み、動物細胞等を用いて作用機序を解明し、モデル動物で下痢症抑制効果の有無を検証することを目的として研究を進めている。３年間の全体計画として、MFRE中に含まれる有効成分の絞り込み、MFREによるコレラ毒素（CTx）の細胞内液過剰漏出抑制の機序解明、下痢症モデル動物を用いたMFREによる下痢症抑制効果の検討、MFREの更なる下痢症抑制効果の検討を掲げた。令和5年度は以下の研究成果があげられた。まず、MFREによって細胞を前処理する場合よりも、CTxを前処理した方が、より効果的なCTxによる細胞内液過剰漏出の抑制効果が認められた。これはつまり、MFREはCTxに直接作用して細胞内液の過剰漏出を抑制しているものと思われた。またその機序に関しては、MFREによるCTxの前処理は、細胞内液過剰漏出の一つ上流の反応に当たる細胞内cAMPの過剰蓄積を抑制した。さらにMFREはその上流側の反応であるADPリボシル化を抑制した。一方、MFREはCTxの細胞表面上の受容体であるGM1ガングリオシドへの結合は阻害しない結果が示され、昨年度と異なる結果となったため更なる検討が必要である。また、MFREによるコレラ菌の処理は、CTxの産生または分泌を有意に減少した。またその効果は、MFREの更なる抽出画分であるFr4が最も大きいものであった。さらにMFREは、コレラ菌の鞭毛運動を抑制し、その結果同菌の活発な運動を著しく抑制した。その効果はMFREの抽出画分であるFr2が最も高いものであった。またFr2はコレラ菌のATP産生を抑制した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
昨年度中にMFREが、1)CTxによる細胞内液過剰漏出を抑制すること、2)コレラ菌によるCTxの産生または分泌を抑制すること、3)コレラ菌の運動を抑制すること、を見出した。R5年度は、MFREから抽出した５画分（Fr1~Fr5）を用いて、以下の通りの成果を得た、すなわち、CTxによる細胞内液過剰漏出の抑制は５つの画分がそれぞれ有意な抑制を示し、画分間に大きな差は認められなかった。MFREはCTxに直接作用して細胞内液の過剰漏出を抑制しているものと思われた。また、MFREによるCTxの前処理は、細胞内液過剰漏出の一つ上流に当たる細胞内cAMPの過剰蓄積を抑制した。さらにMFREはその上流側の反応であるADPリボシル化を抑制した。一方、MFREはCTxのGM1ガングリオシドへの結合は阻害しないことが示唆された。また、コレラ菌によるCTxの産生または分泌は、Fr.4で処理した際に有意な抑制を示した。Fr.2およびFr.4はコレラ菌の活発な運動を著しく抑制した。Fr.2はコレラ菌のATP産生を抑制し、Fr.4はコレラ菌の膜電位を低下させた。これらが運動抑制の機序の可能性があるものと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、1. 質量分析等の手法を用いてそれぞれの有効成分の同定を試みる。すなわちFr.4中に含まれる、コレラ菌からCTxの産生または分泌を著しく抑制する成分をさらに絞り込み、物質の同定を試みる。また同じくFr.2中に含まれる、コレラ菌の運動を著しく抑制する成分をさらに絞り込み、物質の同定を試みる。
2. それぞれの有効成分の機序の解明を試みる。すなわち、MFREおよび抽出画分処理による、CTxによる細胞内液過剰漏出の抑制の機序の解明をさらに進める。MFREによるCTxtとGM1ガングリオシドの結合の阻害の有無に決着をつける。また、MFREおよびその抽出物が、その後のCTxの細胞内への内在化（internalization）に影響を与えるかを検討する。さらに、Fr2によるATP産生の抑制が、コレラ菌の運動抑制にどのように関係するのかを検討する。
3. 下痢症モデル動物を用いた、MFRE及びそれぞれの有効成分による下痢症抑制効果の検討を行う。モデル動物を麻酔下で小腸結紮ループ試験を実施する。
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