| Project/Area Number |
22K05391
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
藤崎 真吾 東邦大学, 理学部, 教授 (70190022)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
茂里 康 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (90357187)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | ウンデカプレニルリン酸 / ウンデカプレニル二リン酸 / オクタプレニルリン酸 / オクタプレニル二リン酸 / 高速液体クロマトグラフィー / イオンペア試薬 / リアルタイムPCR / 糖キャリアリピド / リピドホスファターゼ / リピドキナーゼ / 細胞壁合成 |
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| Outline of Research at the Start |
ウンデカプレニルリン酸は細菌の細胞壁生合成における糖脂質中間体の前駆体であり、ウンデカプレニル二リン酸の脱リン酸化、ウンデカプレノールのリン酸化により生成する。黄色ブドウ球菌のリピドキナーゼ遺伝子dgkA、リピドホスファターゼ遺伝子bacA, pptA, pptBの欠損株を用いて脂質含量および遺伝子発現の測定を行い、これらの遺伝子のウンデカプレニルリン酸の供給およびその調節への寄与を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は黄色ブドウ球菌において細胞壁合成の糖キャリアであるウンデカプレニルリン酸（UP）の細胞膜内側への供給に関わる遺伝子を同定し、その発現調節を解明することである。2023年度には前年度に引き続きUPおよびその直近の前駆体であるウンデカプレニル二リン酸（UPP）の細胞内含量の測定法を検討した。生菌からの抽出、分離、定量の方法を確立し、有効性の検証のため大腸菌に適用した結果を論文として発表した。
市販品のall-E-ノナプレノールおよび黄色ブドウ球菌から抽出した炭素数35, 40, 45, 55のプレノールを化学的にリン酸化して得たプレニルリン酸およびプレニル二リン酸を標準物質として、これらの物質の挙動を確認した。その結果、菌体からこれらの物質をクロロホルム-メタノールで抽出し、イオン交換カートリッジにより分別したのち、イオンペア試薬を含む溶媒を用いるHPLC分析により炭素数35から55のプレニルリン酸、プレニル二リン酸を定量する方法を確立した。従来は菌をアルカリ処理し加水分解により生じたプレニルリン酸をHPLCで分析していたので、リン酸エステル誘導体総量の測定であったが、本研究成果によりUPとUPPを別々に定量して細胞内におけるUPPの脱リン酸化の程度を知ることが可能となった。この方法を大腸菌に適用しオクタプレニルリン酸（OP）、オクタプレニル二リン酸（OPP）、UPおよびUPPを定量した。OP、OPPの合計量はオクタプレニルリン酸エステル誘導体の総量にほぼ等しいのに対して、UP、UPPの合計量はウンデカプレニルリン酸エステル誘導体の総量の52%程度であった。総量との差は糖が結合した中間体によると推測される。OP含量に対するOPP含量の割合が21%であるのに対し、UP含量に対するUPP含量の割合は2.6%でありUPP含量は低く保たれていることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
細胞内のUPPを定量することの重要性は10年以上前から指摘されていたが、UPPを他のUP誘導体と区別して測定した報告例はなかった。2023年度までの研究成果により、菌体中のプレニルリン酸とプレニル二リン酸を抽出して、HPLCにおいて標準物質のソラネシルリン酸、ソラネシル二リン酸とのピーク面積比によりUP, UPPを定量することが可能となった。この方法を黄色ブドウ球菌および大腸菌の細胞内のプレニルリン酸、プレニル二リン酸の定量へ適用することを試みた。いずれの菌の場合もUPP含量はUP含量の10％未満であり菌株や培養条件によるUPP含量の変動の検出には高度の手技を要すること、また、黄色ブドウ球菌の場合、抽出法によるプレノール誘導体の定量値の変動が大きいことがわかった。そこで、まず、大腸菌のプレニル二リン酸合成に関わる遺伝子を多重化した株を用いてプレニル二リン酸が安定的に定量できることを確認した。さらに従来のプレニルリン酸エステルの総量の定量法を併用して、ウンデカプレニルリン酸誘導体中のUPPの割合を推定した。これらの成果を論文にまとめ日本農芸化学会の英文誌Biosci. Biotechnol. Biochem.に発表した。
UPP定量法の大腸菌への適用の論文化を優先したため、黄色ブドウ球菌のリピドホスファターゼ、リピドキナーゼ破壊株の特性や遺伝子産物の酵素活性に関する結果の論文化が達成できなかった。また、UPP定量法を黄色ブドウ球菌に適用するところまで進めることができなかった。このため、進捗がやや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸菌においてUPP含量を正確に測定できるようになったので、リピドホスファターゼ遺伝子（bacA, pgpB, ybjG）欠損株におけるUPP含量を測定しこれらの遺伝子産物のUP生成への寄与を見積もる。また、これらの遺伝子およびその他のUP生成に関わる遺伝子の発現解析を行う。さらに、大腸菌の野生型株およびリピドホスファターゼ遺伝子欠損株に黄色ブドウ球菌のリピドホスファターゼ遺伝子（bacA, pptA, pptB）およびリピドキナーゼ遺伝子（dgkA）を導入して、ポリプレノール誘導体含量およびバシトラシン感受性への影響を調べる。
黄色ブドウ球菌のリピドホスファターゼ遺伝子産物の酵素活性に関する実験結果、および、リピドキナーゼ遺伝子、および3種類のリピドホスファターゼ遺伝子の単独破壊株、多重破壊株の特性とウンデカプレール誘導体含量についての実験結果を論文にまとめる。また、これらの遺伝子発現解析を行う。測定対象とする遺伝子は、リピドキナーゼ遺伝子dgkA, リピドホスファターゼ遺伝子bacA, pptA, pptBに加えて、プレニル二リン酸合成に関わるファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子ispA, オクタプレニル二リン酸合成酵素遺伝子hepT, UPP合成酵素遺伝子uppSなどである。野生型株および破壊株を用いてバシトラシンなどの薬剤添加時の遺伝子発現を測定し、ウンデカプレノール誘導体含量、薬剤感受性のデータと照らし合わせてリピドキナーゼ遺伝子、リピドホスファターゼ遺伝子の相互作用、役割の違いの解明を目指す。
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