| Project/Area Number |
22K05396
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Kansai University |
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Principal Investigator |
山崎 思乃 関西大学, 化学生命工学部, 准教授 (50602182)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片倉 啓雄 関西大学, 化学生命工学部, 教授 (50263207)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 乳酸菌 / 膜小胞 / 免疫賦活活性 / 糖源 / グラム陽性菌 |
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| Outline of Research at the Start |
プロバイオティクスである乳酸菌の一部は免疫賦活活性をもつ微小な膜小胞（MV）を産生する。このMVをワクチンの免疫増強剤や機能性食品などに応用するために、乳酸菌に免疫賦活活性の高いMVを高産生させる。
まず、厚い細胞壁をもつグラム陽性菌の乳酸菌がMVを産生するメカニズムを解明し、利用することで、乳酸菌のMV産生「量」を制御する。また、免疫賦活をもつ菌体成分を培養環境の調節や遺伝子組換えによりMVに多く含ませることで、MVの「質（免疫賦活活性）」の向上にも挑戦する。さらに、MV表面がもつ特性を利用した簡便でマイルドな精製法を確立することで、MVの実用化を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの腸内では多種多様な腸内細菌が腸内細菌叢を形成し、宿主と共生している。腸内細菌叢のバランスの破綻は疾病を誘発することから、乳酸菌がもつ整腸作用が注目されている。我々はこれまでに腸内細菌叢のバランス維持や感染予防を担う免疫グロブリンA（IgA）の産生を増強する乳酸菌Limosilactobacillus antriを見出していたが、本菌株が産生するナノサイズの膜小胞（メンブランベシクル; MV）もIgA産生を増強することを発見した。このMVを機能性食品や粘膜ワクチンの免疫増強剤として応用することを目指しているが、厚い細胞壁をもつグラム陽性菌の乳酸菌においては、産生するMV量の少なさが課題である。そこで本研究では、MVの「量」と「質（免疫賦活活性）」を向上させることを目指し、昨年度は静菌剤として利用されるグリシンを用いて乳酸菌の細胞壁を脆弱化することで、免疫賦活作用を維持したMVの高産生を実現した。本年度は、MVの「質」を高める培養条件の探索を目的とし、L. antriの免疫賦活をもたらす活性成分の一つであるリポテイコ酸（LTA）に着目し、LTA含量の高いMVを高産生させる条件を検討した。その結果、培地の糖源をグルコースからその他の糖源に変更することで、MV産生量のみならず、MVに含まれるLTA量が変化することを見出した。特に、キシロースを糖源とすることで、MV産生量のみならず、脂質当たりのLTA量が増大し、MVの「量」と「質」を両立できる可能性を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リポテイコ酸（LTA）はグラム陽性菌の細胞壁を構成する成分の一つであり、細胞膜にアンカーされ、菌体表層に向かってペプチドグリカン層を縦断する分子である。LTAにはトル様受容体2を介した免疫賦活活性があることが知られており、L. antriの免疫賦活活性においてもLTAが活性本体の一つであることを見出している。本研究ではこれまでに培養条件がL. antriのMV産生量に及ぼす影響を検討してきたが、培地の糖源には一般的なグルコースを用いていた。しかし、グルコース以外の9種の糖（単糖、二糖、三糖）を糖源として本菌株を培養すると、菌体量のみならず、MV産生量とMVの脂質当たりのLTA量が変化することがわかった。中でも、キシロースを糖源とすると、菌体量は約3倍、MV産生量は約60倍に増加し、脂質あたりのLTA量も顕著に増大した。また、マルトースを糖源とすると、キシロースより菌体量および脂質あたりのLTA量は増大することも明らかにしたが、MV産生量はキシロースの1/20程度にとどまった。一方、ラフィノースでの培養では、MV産生量はキシロースの約2倍まで増大したものの、脂質あたりのLTA量は1/4程度であった。これらの結果は、キシロースを糖源とすることで免疫賦活活性の高いMVを高産生できることを示唆するものであり、今後は、キシロースがMV産生の促進やLTA含量の増大をもたらす機構について検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、L. antriを培養する際の糖源を変更し、MV産生量とMVに移行するLTA量を増大させることで、MVの「量」のみならず「質（免疫賦活活性）」を向上できる可能性を示した。最終年度は、より質の高いMVを大量に取得するために、LTA生合成関連酵素の発現量を遺伝子組換え操作により調節することで免疫賦活活性の高いMVを本菌株に産生させることができるかを引き続き検討する。
また、MV研究の進展やMVの実用化には、超遠心分離を用いない簡便な精製法が必須である。そこで、MVの表層分子や物理化学的性質を利用したマイルドかつ高効率なMVの精製法を確立する。
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