油糧酵母を用いて褐藻から油脂への新しい炭素の流れを創造するための基盤研究

Research Project

Project/Area Number	22K05411
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 38020:Applied microbiology-related
Research Institution	Ishikawa Prefectural University
Principal Investigator	河井重幸石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (00303909)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	橋本渉京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	褐藻 / アルギン酸 / マンニトール / 油糧酵母 / Yarrowia lipolytica / アルギン酸リアーゼ / 油脂 / モノウロン酸
Outline of Research at the Start	我が国の海域を含む世界の海域では膨大な量の炭素が褐藻（コンブやアカモクなど）として海中に固定されている。本研究の目的は、油糧酵母Yarrowia lipolytica (Yli) を用いて「海に固定された炭素（褐藻）から油脂へ」の新しい炭素の流れを創造することである。本研究では、同株のDEH資化能を向上させた上で、褐藻のもう一つの主要成分マンニトールをも資化できるように改変する。さらに、アルギン酸リアーゼを、この改変した株の細胞外で分泌発現させ、細胞外でアルギン酸を糖化（DEHへ変換）する。得られた株を用いて褐藻からの油脂生産の最適条件を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	我が国の海域を含む世界の海域では膨大な量の炭素が褐藻（コンブやアカモクなど）として海中に固定されている。本研究の目的は、褐藻および褐藻に含まれるアルギン酸とマンニトールから高い効率で油脂を生産できる油糧酵母Yarrowia lipolytica（Yli）株を構築し、そのYli株を用いて褐藻から油脂を生産する油脂生産系を確立すること、すなわちYli株を用いて褐藻から油脂への新しい炭素の流れを創造することである。既に、DEH（褐藻の主要多糖アルギン酸がエンド型およびエキソ型アルギン酸リアーゼで分解されて生成するモノウロン酸）資化に必要な4つの遺伝子をYli Po1f株に導入することによりDEHを資化できるようにした代謝改変Yli株を構築済み、エンド型アルギン酸リアーゼA1-Iの分泌発現は確認済みである。目的達成のための基盤研究として本年度は、①エキソ型アルギン酸リアーゼの分泌発現、②代謝改変Yli株の油脂蓄積能の増強、③DEH資化能の向上を試みた。 ①に関しては、異なるPLファミリーに属するエキソ型アルギン酸リアーゼ(Atu3025, oalC6, AlyA5)のうちPL7に属するAlyA5の分泌発現を示唆する結果を得た。②に関しては、グルコースからの油脂生産能増強に効果があるとされるDGA1(油脂生産遺伝子)の導入、PEX10（油脂分解に関わる遺伝子）の破壊を代謝改変Yli株に対して行ったところ、これらの導入と破壊は同株のDEH培地での生育を低下させることが分かった。③に関しては、DEH資化に必要な4つの遺伝子、遺伝子の各々に対するプロモーターとターミネーター、マーカー領域、挿入ターゲットであるrDNA領域からなる12断片をGolden Gate法で連結し、連結した断片の導入のみでYli株にDEH資可能を付与できることが分かった。連結した断片を代謝改変Yli株に導入することで、代謝改変Yli株のDEH資化能のさらなる向上が期待された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は3年間で、①DEH代謝の律速段階の特定とDEH資化能の向上、②Yli株のマンニトール代謝機序の解明。Yli株へのマンニトール資化能の付与、③Yli株で最も多く分泌されるエキソ型アルギン酸リアーゼの特定とアルギン酸の糖化、④褐藻を含む様々な炭素源からの油脂生産の最適条件の決定を実施する計画である。 1年目の成果を踏まえ、2年目の令和5年度に、①に関してはDEH資化能の向上を可能にするDNA断片を得た。さらにグルコースからの脂質蓄積能の向上に寄与することが知られるDGA1の導入やPEX10の破壊がDEH培地での生育を低減させることを見いだした。③に関してはエキソ型アルギン酸リアーゼAlyA5の細胞外分泌を示唆する結果を得た。これらの成果から、(2)おおむね順調に推移していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	本年度は、①：R5年度に作出した「DEH資化能の向上を可能にするDNA断片」を代謝改変Yli株に導入することによる同株のDEH資化能のさらなる向上、②：Yli株のマンニトール代謝機序の解明と①で作出したYli株へのマンニトール資化能の付与、③：②で作出した株へでのエンド型およびエキソ型アルギン酸リアーゼの発現、④：③で作出した株を用いての褐藻を含む様々な炭素源からの油脂生産の最適条件の決定を実施する