| Project/Area Number |
22K05426
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
片岡 邦重 金沢大学, 物質化学系, 教授 (40252712)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | マルチ銅オキシダーゼ / 酵素電極 / 電子移動反応 / 化学修飾 / ポリエチレングリコール |
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| Outline of Research at the Start |
マルチ銅オキシダーゼ（MCO）は，電極から直接電子を受容し，酸素を水へと還元できるので酵素燃料電池のカソード電極触媒として利用される。電極の性能は酵素と電極材料との相互作用に大きく依存し，特に直接電子移動型電極の場合，酵素の電子受容部位の配向制御が機能発現の鍵を握る。本研究では，糖鎖構造の差異が電極触媒活性に大きな差として現れるビリルビンオキシダーゼに着目し，N結合型糖鎖を改変することで，電極への配向制御における親水性糖鎖の役割を明らかにする。さらに化学修飾によるポリエチレングリコール誘導体の部位特異的付加を行うことでMCOの配向制御を一般化し，電極用MCOの高機能化技術の開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌Myrothecium verrucaria由来のビリルビンオキシダーゼ(mBOD)は，基質を酸化して得た電子を用いて分子状酸素を水に4電子還元する反応を触媒する。BODは直接電子移動型の電極触媒活性（DET活性）が非常に高く，酵素燃料電池のカソード電極触媒への応用が期待されているが，発現宿主によりDET活性は大きく異なる。本研究初年度では，BODのAsn472, Asn482に付加したN結合型糖鎖の構造や電荷の違いがDET活性に影響を与えることを明らかにした。そこで本研究２年目では，糖鎖修飾のない大腸菌発現型BOD(eBOD)をベースに，糖鎖結合残基のAsn472・Asn482をCysに置換し，Cys残基特異的化学修飾により電荷や構造の異なる4種類のポリエチレングリコール（PEG）を糖鎖ミミックとして付加することで，PEG鎖が酵素配向に与える影響を詳細に評価した。
N472C, N482CのPEG修飾には，それぞれ，短鎖PEG(PEG12)，長鎖PEG(PEG24)，分岐鎖PEG(PEG(4＋4×3))，短鎖PEG末端にカルボキシ基を持つ酸性PEG(PEG12+acid)の4種類を用いた。野生型eBODは負に帯電した電極上でDET活性が増大することから，eBODの電極配向は静電相互作用により制御されることがわかった。また，472位の短鎖PEG修飾ではDET活性が顕著に低下し，482位の修飾では変化がないことから，472位の修飾がBODの電極配向に大きな影響を及ぼすと考えられる。負に帯電した電極を用い，N472C-PEG修飾酵素のDET活性を比較したところ，長鎖PEG，分岐鎖PEG修飾酵素は短鎖PEG修飾酵素に比べて大きく活性が低下し，また，酸性PEG修飾酵素では活性が回復したことから，PEGの負電荷が負に帯電した電極と反発し，酵素配向が改善すると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究初年度にはBODに結合した糖鎖の組成と大きさが電極への配向に寄与していることを明らかにした。続いて令和５年度には糖鎖結合部位である２つAsn残基をCysに置換した変異体を大腸菌で発現させ，ポリエチレングリコール（PEG）で修飾することで電極配向の制御を試みた。Asn472位をPEG修飾するとDET活性が大きく変化することから，472位のPEG鎖（糖鎖）が，BODの電極配向に重要な役割を果たすことを明らかにした。本研究の最終年度に向け，BOD電子需要部位（基質結合部位）近傍の分子表面にCys残基を導入した変異体の調整を行なっている。PEG以外の修飾剤を用いる化学修飾の検討も始めており，おおむね順調に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の最終年度である令和６年度は，前年度に引き続き，大腸菌で発現させた糖鎖を持たないeBODをベースタンパク質に用いて，電子受容部位近傍の分子表面にCys残基を導入し，Cys残基特異的な化学修飾によりPEG鎖をはじめとする有機分子を導入する事により，電極配向をより直接的に制御する方法を検討する予定である。また，親水性高分子の部位特異的付加の方法論を，別のマルチ銅オキシダーゼである大腸菌の一価銅オキシダーゼCueOにも応用し，親水性高分子による電極触媒活性制御の一般化を試みる。
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