| Project/Area Number |
22K05441
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三上 文三 京都大学, 生存圏研究所, 研究員 (40135611)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 常温X線結晶構造解析 / キャピラリーＸ線構造解析 / 酵素基質複合体のpH変化 / 酵素反応機構 / β-アミラーゼ / 非凍結X線結晶構造解析 / 常温Ｘ線結晶構造解析 / 酵素のpHによる構造変化 / 結晶内酵素反応 / X線結晶構造解析 / 非凍結結晶 / 構造生物学 |
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| Outline of Research at the Start |
酵素の多才な働きは酵素が基質と相互作用するときに生じる酵素タンパク質の構造変化によって発揮されている。タンパク質の構造はタンパク質を結晶化して回折X線を測定する
X 線結晶構造解析が最も精度の高い方法である。通常の回折X線の測定ではより高い分解能を得るために凍結結晶を用いて測定されているが、凍結の影響によってタンパク質の微細な構造変化が検出されない場合が多い。そこで、本研究では数種類の酵素の結晶をガラスキャピラリーに封じて非凍結状態で回折データの測定を行い、これらの酵素と基質との複合体構造のpH変化を正確に測定することを目指している。
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素の多才な機能は酵素タンパク質の構造変化によって発揮される。タンパク質の構造変化を研究する手段としてはX線結晶構造解析が有効であり、一般に行われているX線結晶構造解析ではX線損傷の軽減と分解能の向上を図るため凍結結晶を用いて回折データが測定されている。しかし、凍結による結晶格子の縮小とpHの変化の影響が大きく、真の構造変化を捉えるのが困難である。さらに凍結保護剤の影響も無視できない。本研究では簡便な非凍結結晶のマウント法の開発と非凍結法を駆使した酵素機能の解明を行う。対象の酵素としては申請者が長年研究しているβ-アミラーゼの他、ソーマチン、CYP105Aおよびトランスグルタミナーゼ等について、基質およびリガンドとの複合体の構造解析と複合体構造のｐHの変化による構造変化を明らかにすることを試みている。令和5年度はキャピラリー法を用いたβ-アミラーゼと基質アナログ複合体（グルコース、マルトース）および基質であるマルトペンタオースとの複合体の構造のpH依存性の検討を行った。また、CYP105Aとスタチン類との複合体の構造解析を行い。スタチンとの複合体構造は非凍結測定によってのみ得られることを明らかにした。さらに、ソーマチン構造のpH変化を明らかにするために、前年度に引き続きキャピラリーを用いた測定をpHを3.5から11まで変化させた測定を行った。その他、凍結保護剤の影響を排除するためフェルロイルエステラーゼと基質との複合体の非凍結データの測定を行った。コラーゲナーゼとキシラナーゼについては基質複合体の凍結結晶を用いて構造解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は簡便な非凍結結晶の回折データの測定法の開発と非凍結法を駆使した酵素機能の解明にあるが、従来のキャピラリー封入法よりも優れた簡便な調製法の開発については難航している。その理由はタンパク質の結晶によって、大きさや結晶化母液が大きく異なり、一般化が難しい点にあり、現在更なる改良を試みている。一方、従来のキャピラリー封入法を用いた非凍結結晶の解析については順調に進展し、野生型β-アミラーゼのグルコースおよびマルトース複合体構造のpH依存性およびβ-アミラーゼ変異体酵素（E186AとE380A）と基質のマルトテトラオース複合体構造のpH依存性については回析データ収集と構造の精密化をほぼ終了している。また、CYP105Aとスタチン類との複合体の凍結結晶と凍結結晶の構造比較を行った結果、凍結結晶ではスタチン類（メバスタチンとシンバスタチン）が全く結合しないのに対して非凍結条件では結合が認められ、DDTやMPDなどの添加剤がプロダクティブな結合を阻害することを見出した。さらに、ソーマチンについては前年度に引き続き、キャピラリーを用いた測定をpHを3.5～11まで変化させて行い凍結結晶の回折データも収集し、高分解能での構造比較を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．非凍結晶サンプルの簡便な測定法と連続測定法の開発―については更なる改良を行うが、当面の非凍結の構造解析には従来のキャピラリー法を活用する。キャピラリー法の分解能を向上させるために、複数の結晶をキャピラリーに封入し、より強いX線を短時間用いる測定法について検討する。
２．機能解析用の結晶化スクリーニングキットの作製―については硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム等を結晶化剤とするスクリーニングキットの開発を引き続き行う。また、ポリエチレングリコール（PEG）を結晶化剤として得られた結晶の母液を塩に置き換えて結晶の長期保存を行う方法についても検討する。
３．β‐アミラーゼの反応機構の解明―については既に得られている非凍結結晶の構造解析結果（グルコース複合体とマルトース複合体のpH依存性およびβ-アミラーゼ変異体酵素と基質のマルトテトラオース複合体構造のpH依存性）について論文発表を行う。
４．CYP105Aと非ステロイド系消炎剤との複合体の構造解析および非凍結結晶を用いたCYP105Aとスタチン類との複合体の構造解析の結果について論文化する。
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